曼氏裂头蚴病是由曼氏迭宫绦虫(Spirometra mansion，Sm)的幼虫一曼氏裂头蚴(plerocercoid)侵入机体引起的一种人兽共患性疾病。裂头蚴侵入皮下组织形成结节，最大危害在于侵入艮部和中枢神经系统，可致残、严重危及生命[1]。我国已报道千余例曼氏裂头蚴病例，广泛分布于23个省、市、自治区[2]。　　 裂头蚴在人体内移行，寄生部位多变，缺乏特异性临床表现，容易引起误诊、漏诊。诊断常用方法主要有病原学、影像学和免疫学方法。目前，我国曼氏裂头蚴病诊断标准尚不明确，亦无商品化的诊断试剂面市，此病最终通过手术或活检得以确诊和治疗。近年来，随着现代影像学技术的普及，裂头蚴病，特别是中枢神经系统病例的报道越来越多，CT、MRI、超声检查等影像学检查亦是一种重要的辅助诊断。但是曼氏裂头蚴感染者往往起病隐匿，局部包块影像学表现与肿瘤难以区分，往往被误诊、漏诊。免疫学检测方法有其独特的优点：敏感性高、简捷同时创伤性小，是一种较为理想的临床辅助诊断手段。但是，曼氏裂头蚴与其它寄生虫尤其是蠕虫之间存在较为严重的交叉反应，粗抗原作为诊断抗原敏感性较高，但特异性差，故其免疫学诊断的准确性不够高。因此，利用基因重组技术制备曼氏裂头蚴特异性抗原，对曼氏裂头蚴病免疫诊断具有重要意义。　　 目的：　　 构建了曼氏裂头蚴cDNA文库并进行大规模测序筛选和生物信息学分析，并从中挑选具有潜在诊断价值的抗原基因进行克隆表达，在此基础上对候选分子的免疫学特性以及诊断价值进行了初步验证，为曼氏裂头蚴的致病性及诊断方法的研究提供基因谱信息及进一步研制曼氏裂头蚴免疫诊断试剂盒提供实验基础。　　 方法：　　 1.曼氏裂头蚴cDNA文库的构建、筛选及生物信息学分析　　 利用SMART技术构建曼氏裂头蚴全长cDNA文库，从cDNA文库中随机挑取克隆，摇菌后提取质粒，使用通用引物PCR扩增，将PCR产物大小＞500bp片段进行测序。对得到的有效序列进行生物信息学分析，经编辑后的序列通过NCBI数据库的BLASTN、BLASTX软件进行分析，选取有诊断意义的基因为候选基因。　　 2.候选基因的克隆、表达用其免疫学特性分析　　 采用多聚酶链反应(PCR)技术扩增出候选克隆的插入片段，运用直接测序技术测定插入cDNA片段的核苷酸序列，经编辑后的序列通过NCBI数据库的BLASTN、BLASTX软件及其他生物信息学预测软件进行分析。PCR扩增侯选基因开放读码框，克隆到载体pET32a(+)中，并进行诱导表达、纯化重组蛋白后对重组蛋白进行质谱鉴定。提取曼氏裂头蚴的总RNA并反转录合为cDNA，设计侯选基因的特异性引物，采用RT-PCR对候选编码基因的表达水平进行分析。用纯化的重组蛋白免疫小鼠，制备抗血清，以该血清作为探针，对重组蛋白进行Western blot。以曼氏裂头蚴感染者的血清作为免疫探针，纯化的重组蛋白作为抗原进行Western blot分析。以纯化融合蛋白为抗原，包被酶联免疫反应板，用间接ELISA法检测曼氏裂头蚴感染者血清，评价其敏感性和特异性。应用已优化的ELISA检测体系，以重组Sm18作为包被抗原，对其诊断曼氏裂头蚴感染的敏感性和特异性进行初步评价。　　 结果:　　 1.曼氏裂头蚴cDNA文库的构建、筛选及生物信息学分析结果　　 成功构建了曼氏裂头蚴cDNA文库，从cDNA文库中随机挑取530个克隆，扩增其插入片段，将条带＞500bp的487个PCR产物送测序，得到418条有效序列，通过聚类分析合并为325条序列，其中全长序列139条，为曼氏裂头蚴的致病性及诊断抗原的研究提供了有价值的基因表达谱信息。序列分析发现，第81号克隆序列编码与GenBank中的TSES33 diagnostic antigen[Taenia solium]Genebank：CAX86983.1具有一定同源性，可能有作为诊断抗原的研究价值，其理论分子量为18kDa，为此，将该基因暂时命名为曼氏裂头蚴诊断抗原18(diagnostic antigen ofSparganum mansion Sm18)基因，并进行进一步的研究。　　 2.Sm18的重组表达及免疫学特性鉴定结果　　 经PCR、酶切及测序验证该目的基因克隆成功。将成功构建的重组子pET32a(+)-Sm18经IPTG诱导表达，在较宽的温度范围和IPTG诱导浓度范围内都获得了很好的表达；His亲和层析柱纯化的重组表达产物(rSm18)分子大小约为35kDa经质谱鉴定，证明是Sm18蛋白。采用RT-PCR对候选编码基因的表达水平进行分析，结果表明Sm18在曼氏迭宫绦虫中绦期-裂头蚴有转录。以制备的rSm18多抗血清为一抗进行Western blot，结果显示重组蛋白识别到一大小约33kDa的条带。纯化后的重组蛋白rSm18能被曼氏裂头蚴感染者血清所识别，Western Blot鉴定发现在33kDa左右处可见一条明显的免疫反应带，而阴性对照血清在相应的位置未识别出该蛋白条带。以rSm18作为抗原，建立了基于ELISA的检测特异性抗体的免疫学方法，rSm18的最佳包被浓度为12.5μg/ml，最适封闭条件为5％脱脂牛奶，37℃封闭1.5h；最适血清反应条件为1∶400稀释，37℃温育90min；酶标二抗1∶20000稀释，37。℃温育1h；以TMB显色2min左右为佳。间接ELISA方法对标准血清以可溶性粗抗原(PSA)为包被抗原检测敏感性为90％，特异性为68％，符合率73％；以rSm18为包被抗原检测感染者以及非感染者的血清敏感性为92％，特异性为81％，符合率为84％。　　 结论:　　 获得了325条曼氏裂头蚴表达基因的EST序列，其中全长序列139条，为曼氏裂头蚴的致病性及诊断抗原的研究提供了有价值的基因表达谱信息。从曼氏裂头蚴cDNA文库中分离到诊断抗原(Sm18)，并成功构建了该基因的高效原核重组表达体系，制备了可以用于免疫诊断的重组抗原。Western blot结果初步显示rSm18具有较好的免疫原性和免疫反应性。以该分子作为抗原检测曼氏裂头蚴感染者血清中特异性IgG具有较高的特异性和敏感性。本研究证明rSm18在曼氏裂头蚴病诊断试剂盒的研发中具有潜在的价值，值得进一步研究开发。