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乙型肝炎病毒(HBV)感染会导致慢性乙型肝炎(CHB)的发生,同时也是引起肝硬化、肝细胞癌的重要相关因素。据流行病学资料显示,全世界有20多亿人为HBV病毒感染者,其中约有4亿人为慢性感染者。估计,每年超过50万人死于HBV感染所导致的肝硬化、肝衰竭和肝细胞癌。中国是HBV感染的高发地区,约有10%的人口为HBV携带者,HBV感染带来的健康和经济问题已成为忧国忧民的难题。20世纪90年代以来,重组干扰素及核苷类似物药物的开发与应用,使CHB的治疗取得了一定进展,但是这些药物存在不能完全清除病毒、易产生耐药性、毒副作用大及药价昂贵等一系列问题。因此,迫切需要寻求高效、安全、廉价的抗HBV药物。近年来,中医药在治疗HBV方面显示出很大潜力。现已证明,一些中药单体如:青蒿素、苦参碱和苦参碱脂质体、木香烯内酯、珍珠草提取物鞣花酸及虎杖提取物白藜芦醇等在体外试验中对乙肝病毒均有不同程度的抑制作用。黄芪为豆科多年生草本植物膜荚黄芪和蒙古黄芪的干燥根,含有多糖、黄酮、皂甙、氨基酸和十几种微量元素等多种成份。近几年研究发现,黄芪中含有多种抗病毒成份。黄芪甲甙是黄芪皂甙类有效单体成份,有抗炎、抗高血压、糖尿病和抗病毒等广泛的药理作用。但其抗HBV作用的实验研究未见报道。本研究拟通过观察黄芪甲甙对体外HBV的作用,以期为黄芪甲甙的进一步开发研究奠定基础,也为我国抗HBV新药研制提供一些思路。实验内容:实验一HepG2.2.15细胞株的检测HBsAg和HBeAg检测目的观察HepG2.2.15细胞上清液中HBsAg和HBeAg的分泌。方法培养细胞,设ELISA试剂盒中阳性对照剂为阳性对照,含血清培养液为阴性对照,第10天、20天、30天的HepG2.2.15细胞培养上清液为实验组。使用ELISA(酶联免疫吸附测定法)法检测培养上清中的HBsAg或HBeAg,显色反应完成后选用450nm波长在自动酶标仪上读取各孔A值。结果HepG2.2.15细胞能稳定地分泌HBsAg和HBeAg,且与时间成正相关。结论在本次实验,HepG2.2.15细胞分泌稳定,是良好的体外模型。实验二黄芪甲甙体外抗乙型肝炎病毒的作用1药物对细胞的毒性试验目的观察黄芪甲甙对HepG2.2.15细胞的毒性作用。方法用不同浓度黄芪甲甙培养液培养细胞,同时,设浓度为10 mg/L、5.0 mg/L和1.0 mg/L拉米夫定为阳性对照组[22, 23]和仅加细胞培养液的阴性对照组。在第9天,用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)比色法检测药物对细胞的毒性。结果浓度为100 mg/L和50 mg/L的黄芪甲甙对HepG2.2.15细胞的抑制率分别为50.6%和35.1% , TC50(半数毒性剂量)为97.4 mg/L[24]。拉米夫定在10 mg/L～1.0 mg/L浓度对细胞的抑制率为10.5%～6.9%结论黄芪甲甙对细胞的毒性作用非常小。拉米夫定在本实验浓度对细胞生长未见明显毒性作用。2 HBsAg和HBeAg的测定目的探讨黄芪甲甙对培养上清中HBsAg和HBeAg分泌的抑制作用。方法使用ELISA法检测培养上清中的HBsAg或HBeAg。显色反应完成后选用450nm波长在自动酶标仪上读取各孔A值,计算抗原抑制率。结果不同浓度黄芪甲甙和拉米夫定对HBsAg和HBeAg分泌均有一定抑制作用,且随剂量的增加,治疗时间的延长抑制作用也随之增加。黄芪甲甙给药6日,其HBsAg和HBeAg的50%抑制浓度(IC50)分别为53.5 mg/L和59.4 mg/L;给药9日,其HBsAg和HBeAg的IC50分别为22.1 mg/L和26.2 mg/L。在第9日,黄芪甲甙的HBsAg和HBeAg治疗指数(TI)分别为4.4和3.7。拉米夫定给药6日,其HBsAg和HBeAg的抑制率分别为:25.3%～3.5%和39.6%～3.6%;给药9日,其HBsAg和HBeAg的抑制率分别为:35.2%～2.7%和43%～4.2%。结论黄芪甲甙和拉米夫定对培养上清中HBsAg和HBeAg的分泌均有一定的抑制作用,且与剂量-时间成正相关。3 HBV DNA的检测目的探讨黄芪甲甙对培养上清中HBV DNA分泌的作用。方法采用荧光定量PCR法分析黄芪甲甙对细胞培养上清液中HBV DNA含量的影响。结果黄芪甲甙和拉米夫定均有一定程度的抗HBV DNA的作用。黄芪甲甙给药6日,其HBV DNA的IC50为39.9 mg/L;给药9日其HBV DNA的IC50为13.2 mg/L,TI为7.4。拉米夫定给药6日,其HBV DNA的抑制率为:36.4%～3.4%;给药9日其HBV DNA的抑制率为:49.5%～5.8%。结论黄芪甲甙和拉米夫定体外对HBV DNA均有一定的抑制作用。