胆管癌是一种恶性程度很高的肿瘤性疾病，早期无特异性诊断标准，诊断明确时多已是晚期，已失去了手术时机；且目前临床常用化疗药物对胆管癌均疗效较差。因此，寻找新型的对胆管癌敏感的治疗药物具有非常重要的意义。表遗传学主要研究没有DNA序列改变的可遗传表达改变，即提供何时、何地和如何应用遗传学信息的指令，以确保基因适当的表达或关闭。当人类进入后基因组时代，尤其是人类表观基因组计划的提出和实施后，表遗传学引起了越来越多的关注，并逐渐成为阐明基因组功能的关键研究领域，也为研究肿瘤的治疗提出一个全新的方向。表遗传的改变主要是对基因序列的修饰，而不改变基因序列本身，因此它是可逆的，这为利用表遗传学方法治疗肿瘤提供了理论依据。现阶段，许多肿瘤亚型缺少染色体或者微卫星不稳定性的事实挑战了基因组不稳定在启动和维持肿瘤发生、发展上起主要作用的假说。肿瘤特异性的以表遗传学改变为基础的通过异常DNA甲基化、异常组蛋白修饰以及异常的核小体定位而导致的基因表达的改变被认可为肿瘤发生的驱动因素，其中肿瘤抑制基因的灭活和原癌基因的活化是癌变的中心事件。因此，通过表遗传药物逆转肿瘤细胞异常表遗传改变，恢复沉默抑癌基因表达，进而达到治疗肿瘤的目的，成为了我们课题组的研究方向。在邹声泉教授的带领下，本课题组研究证实了DNA甲基化酶抑制剂5-Aza-CdR具有在体外抑制胆管癌细胞增殖、促进细胞调亡的作用；并证实联合下调DNA甲基转移酶DNMT1和DNMT3b能使RASSF1A基因启动子区域去甲基化并诱导其重新表达，表明抑制DNA甲基转移酶可使抑癌基因启动子区去甲基化，恢复表达。近年来，研究者逐步发现，抑癌基因沉默的根本原因是染色质结构变得致密，影响了转录起始因子与DNA上相应转录起始部位的结合，而正是抑癌基因启动子区的超甲基化和组蛋白的脱乙酰化决定了染色质的变构。根据这一发现，和以前研究基础，本试验研究了DNA甲基化酶抑制剂（肼屈嗪）与组蛋白脱乙酰化酶抑制剂（丙戊酸）联用对胆管癌细胞QBC₉₃₉增殖、细胞侵袭转移力以及细胞中抑癌基因表达的影响。另外，近两年发现第三类组蛋白脱乙酰化酶Sir2家族中SIRT1蛋白在导致抑癌基因沉默以至肿瘤的发生中有非常重要的作用，为此我们专门探讨了DNA甲基化酶抑制剂、组蛋白脱乙酰化酶抑制剂与SIRT1之间的关联性。在研究中我们发现对于组蛋白脱乙酰化酶抑制剂不敏感的SIRT1在组蛋白脱乙酰化酶抑制剂与DNA甲基化酶抑制剂联合作用下表达减少。进一步研究后明确了恢复HIC1基因表达，抑制SIRT1表达是组蛋白脱乙酰化酶抑制剂与DNA甲基化酶抑制剂联合作用胆管癌细胞中抑癌基因表达的机制之一。本研究为进一步明确组蛋白脱乙酰化酶抑制剂与DNA甲基化酶抑制剂联合作用机制、明确表遗传学变化间的关系奠定了基础，并为利用表遗传学方法治疗胆管癌提供了实验依据。第一部分：DNMTi与HDACi对胆管癌细胞的干预效应论文1．DNMTi与HDACi对胆管癌细胞中抑癌基因表达的影响目的研究肼屈嗪与丙戊酸联合作用对于体外胆管癌细胞QBC₉₃₉中P16、RASSF1A、E-Cadherin等抑癌基因mRNA及蛋白表达，以及启动子区甲基化状态的影响。方法将胆管细胞QBC₉₃₉分为空白组、单用丙戊酸组、单用肼屈嗪组与两药合用组，相应给予丙戊酸、肼屈嗪以及两药联用，空白组给予等量RPIM-1640培养液，干预48h后，RT-PCR、Western-blot法检测各组细胞中P16、RASSF1A、E-Cadherin基因mRNA及其蛋白表达；MSP法检测各组细胞中P16、RASSF1A、E-Cadherin基因启动子区甲基化状态。结果1．空白组胆管癌细胞QBC₉₃₉中P16基因表达量极低，RASSF1A与E-Cadherin基因均未见表达；单用丙戊酸组细胞中P16、RASSF1A及E-Cadherin基因表达量与其空白组一致；单用肼屈嗪组细胞中P16、RASSF1A及E-Cadherin基因表达量较空白组及单用丙戊酸组增多（P＜0．01）；两药联用组细胞中P16、RASSF1A及E-Cadherin基因表达量较其它三组明显增高（P＜0．01）。2．空白组中胆管癌细胞QBC₉₃₉P16蛋白表达量极低，未见RASSF1A与E-Cadherin蛋白表达；单用丙戊酸组细胞三种蛋白表达量与其空白组一致；单用肼屈嗪组细胞中三种蛋白表达量较空白组和单用丙戊酸组增多（P＜0．01）；两药联用组细胞中P16、RASSF1A及E-Cadherin蛋白表达量较其余三组明显增高（P＜0．01）。3．空白组胆管癌细胞QBC₉₃₉中，P16基因启动子区呈部分去甲基化；RASSF1A、E-Cadherin基因启动子区超甲基化；单用丙戊酸组细胞RASSF1A、E-Cadherin基因启动子区仍呈超甲基化状态，P16基因启动子区仍呈部分去甲基化状态；单用肼屈嗪组细胞中三种基因启动子区均呈部分去甲基化状态；两药联组细胞中三种抑癌基因启动子区呈完全去甲基化状态。结论肼屈嗪与丙戊酸两药合用可诱导胆管癌细胞QBC₉₃₉中P16、RASSF1A、E-Cadherin三种抑癌基因启动子区完全去甲基化，并可促进三种基因mRNA及其蛋白大量恢复表达；而单用一种药物效果明显弱于两药合用。论文2．DNMTi与HDACi对胆管癌细胞生长与侵袭转移力的影响目的探讨肼屈嗪与丙戊酸联合作用对于体外胆管癌细胞QBC₉₃₉生长与侵袭转移力的影响。方法将胆管细胞QBC₉₃₉分为空白组、单用丙戊酸组、单用肼屈嗪组与两药合用组，相应给予丙戊酸、肼屈嗪以及两药联用，空白组给予等量RPIM-1640培养液，48h后1．流式细胞术Annexin V／PI双标法检测各组细胞的凋亡情况；2．Transwell法检测各组细胞侵袭转移力；结果1．空白组细胞凋亡率为（2．855±0．936）％，单用丙戊酸组细胞凋亡率为（1 1．56±1．590）％，单用肼屈嗪组细胞凋亡率为（24．65±2．330）％；两药合用组细胞凋亡率为（47．93±3．973）％。两药合用组凋亡细胞较单用药组调亡细胞数量明显增多（P＜0．01）。2．计数移至微孔下层的细胞，结果显示空白组细胞侵袭转移力最强（P＜0．01）；肼屈嗪与丙戊酸联合作用组细胞侵袭转移力最弱（P＜0．01）；肼屈嗪组细胞侵袭转移力较丙戊酸组弱（P＜0．01）。结论单用肼屈嗪与单用丙戊酸均可引起体外胆管癌细胞QBC₉₃₉不同程度凋亡；但两药合用致使细胞凋亡数量远多于单用一种药物；单用肼屈嗪与单用丙戊酸均可引起体外胆管癌细胞QBC₉₃₉侵袭转移力不同程度减弱，但两药合用效果明显强于单用一种药物。表明两药合用在致细胞凋亡及降低胆管癌细胞QBC939侵袭转移力方面有增效作用。第二部分：DNMTi与HDACi对胆管癌细胞中SIRT1基因表达的调节论文3．DNMTi与HDACi通过恢复胆管癌细胞中HIC1基因表达抑制SIRT1基因表达目的探讨肼屈嗪与丙戊酸对胆管癌细胞QBC₉₃₉中SIRT1基因表达的影响及调节机制。方法将正常胆管上皮细胞HIBEC-HR和胆管癌细胞QBC₉₃₉均分别分为空白组、单用丙戊酸组、单用肼屈嗪组及两药合用组，相应给予丙戊酸、肼屈嗪以及两药联用，空白组给予等量RPIM-1640培养液，干预48h后，RT-PCR、Westen blot法检测各组胆管癌细胞QBC₉₃₉中SIRT1、HIC1基因mRNA及其蛋白表达；RT-PCR法检测各组正常胆管上皮细胞HIBEC-HR中SIRT1基因mRNA及其蛋白表达；构建含HIC1基因干扰片段质粒，将胆管癌细胞QBC₉₃₉分为两药合用组、两药合用+阴性对照组、两药合用+干扰质粒组，两药合用+阴性对照组与两药合用+干扰质粒组内分别转染阴性质粒和干扰质粒，两药合用组转染液中不含质粒，转染完成后以两药联用干预各组细胞，48h后，RT-PCR、Westenblot法检测干扰HIC1基因后两药联用对SIRT1基因mRNA及其蛋白表达的影响结果1．空白组、单用肼屈嗪组与单用丙戊酸组胆管癌细胞QBC₉₃₉间SIRT1基因及其蛋白表达无统计学差异（P＞0．05），两药联用组胆管癌细胞QBC₉₃₉内SIRT1基因及蛋白的表达较其余三组明显降低（P＜0．01）；两药联用组内HIC1基因及其蛋白表达较单用药组以及空白组明显增高（P＜0．01），空白组与单用丙戊酸组内无HIC1基因及其蛋白表达，单用肼屈嗪组中可见HIC1基因及蛋白的少量表达。2．干预后各组间正常胆管上皮细胞HIBEC-HR内SIRT1基因及蛋白表达无统计学差异（P＞0．05）。3．抑制HIC1基因表达后，两药合用+干扰质粒组内细胞SIRT1基因及其蛋白表达较两药合用组和两药合用+阴性质粒组明显增强（P＜0．01），而后两组间SIRT1表达无统计学差异（P＞0．05）。结论肼屈嗪与丙戊酸联合作用通过上调HIC1基因表达降低胆管癌细胞QBC₉₃₉内SIRT1基因表达。第三部分：DNMTi与HDACi联合作用抑制胆管癌细胞中SIRT1表达恢复RASSF1A基因表达论文4．DNMTi与HDACi联合作用抑制胆管癌细胞中SIRT1表达恢复RASSF1A基因表达目的探讨SIRT1在肼屈嗪与丙戊酸联合恢复胆管癌细胞QBC₉₃₉RASSF1A基因表达中的作用。方法成功构建含HIC1基因干扰片段质粒，将培养的胆管癌细胞QBC939分为：两药合用组（H+V组）；两药合用+阴性对照组（H+V+pHK组）；两药合用+干扰质粒组（H+V+pSihHIC1-2组），两药合用+阴性对照组与两药合用+干扰质粒组内分别转染阴性质粒和干扰质粒，两药合用组转染液中不含质粒，转染完成后以两药联用干预各组细胞，48h后，RT-PCR、Western blot法检测各组细胞中RASSF1A基因及其蛋白表达；另取胆管癌细胞分为两组，分别为：两药合用+干扰质粒组（H+V+pSihHIC1-2组）和两药合用+干扰质粒+烟酰胺组（H+V+pSihHIC1-2+NAM组），转染含HIC1基因干扰片段质粒成功后给予相应药物干预48h后，RT-PCR、Western blot法检测各组细胞中RASSF1A基因mRNA及其蛋白表达；MSP法检测各组细胞中RASSF1A基因启动子区甲基化状态；结果1．RT-PCR结果显示，两药合用组与两药合用+阴性对照组中RASSF1A基因mRNA表达较两药合用+干扰质粒组强（P＜0．01）；Western blot结果与RT-PCR一致，两药合用组与两药合用+阴性对照组中RASSF1A蛋白表达较两药合用+干扰质粒组高（P＜0．01），MSP结果显示，三组细胞RASSF1A基因启动子区甲基化状态一致，都呈完全去甲基化状态。2．RT-PCR结果显示，两药合用+干扰质粒组中RASSF1A基因mRNA表达较两药合用+干扰质粒+烟酰胺组明显减弱（P＜0．01）；Western blot结果显示两药合用+干扰质粒组中RASSF1A蛋白表达较两药合用+干扰质粒+烟酰胺组明显减弱（P＜0．01）。3．各组细胞中RASSF1A基因启动子区均呈去甲基化状态结论SIRT1参与了肼屈嗪与丙戊酸恢复胆管癌细胞QBC₉₃₉中抑癌基因RASSF1A表达的过程；恢复HIC1表达继而抑制SIRT1表达，是肼屈嗪与丙戊酸恢复胆管癌细胞QBC₉₃₉中抑癌基因RASSF1A表达的机制之一。SIRT1表达改变对抑癌基因启动子区甲基化状态无影响。小结本课题从利用DNA甲基转移酶抑制剂（肼屈嗪）与组蛋白脱乙酰化酶抑制剂（丙戊酸）对体外胆管癌细胞的干预效果入手，研究了两药对于体外胆管癌细胞QBC₉₃₉的干预效应；并通过RNA干扰技术抑制HIC1基因表达研究了肼屈嗪与丙戊酸对于SIRT1表达的调节作用，继而研究了SIRT1基因在肼屈嗪与丙戊酸联合作用恢复体外胆管癌细胞QBC939细胞抑癌基因表达中发挥的作用。根据以上研究，得出以下结果和创新点：1．本课题首次研究了甲基化酶抑制剂（肼屈嗪）与组蛋白脱乙酰化酶抑制剂（丙戊酸）对于体外胆管细胞QBC₉₃₉的干预效应，发现两药在恢复QBC₉₃₉细胞中抑癌基因表达、诱导细胞调亡以及降低细胞侵袭转移力上具有增效作用，即1+1＞2的作用。显示出两药合用对于胆管癌的治疗有较好的前景。2．同时用肼屈嗪与丙戊酸干预胆管癌细胞QBC₉₃₉与正常胆管上皮细胞HIBEC-HR，发现QBC₉₃₉细胞中SIRT1表达降低而HIBEC-HR细胞中SIRT1表达不变，表明QBC₉₃₉细胞中SIRT1发生了异常表达。3．通过构建并转染含HIC1基因干扰片段质粒到胆管癌细胞QBC₉₃₉中，再给予两药同时干预转染后细胞，检测SIRT1表达发现，甲基化酶抑制剂与组蛋白脱乙酰化酶抑制剂联合作用可通过恢复HIC1基因表达降低第三类组蛋白脱乙酰化酶抑制剂（Sir2）成员SIRT1的表达。4．通过转染含HIC1基因干扰片段质粒进QBC₉₃₉细胞内，同时给予肼屈嗪丙戊酸和烟酰胺干预转染后细胞，观察QBC₉₃₉细胞中RASSF1A基因表达变化，发现SIRT1参与了肼屈嗪与丙戊酸恢复胆管癌细胞QBC₉₃₉中抑癌基因RASSF1A表达的过程。这一结果表明，恢复HIC1表达继而抑制SIRT1表达，是肼屈嗪与丙戊酸联会作用恢复胆管癌细胞QBC₉₃₉中抑癌基因RASSF1A表达的机制之一。5．本试验揭示了DNA甲基转移酶、组蛋白脱乙酰化酶对SIRT1异常表达的调节作用，阐明了SIRT1在DNA甲基转移酶与组蛋白脱乙酰化酶恢复胆管癌细胞QBC939抑癌基因RASSF1A表达中的作用。同时，发现了SIRT1这一DNA甲基转移酶与组蛋白脱乙酰化酶联合作用的效应因子，为今后继续发现其他效应因子及针对效应因子研究肿瘤的治疗奠定了基础。