【摘 要】
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VLGR1(The very large G protein coupled receptor 1)是目前已知最大的 G 蛋白偶联受体(G protein coupled receptor,GPCR),其 mRNA 长 19 kb,编码 6299个氨基酸。耳蜗中,VL
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VLGR1(The very large G protein coupled receptor 1)是目前已知最大的 G 蛋白偶联受体(G protein coupled receptor,GPCR),其 mRNA 长 19 kb,编码 6299个氨基酸。耳蜗中,VLGR1主要定位在毛细胞听纤毛根部,是踝连接(Ankle link)复合物的主要组成部分。小鼠中Vlgr1突变会导致听纤毛发育异常且听力受损,人类中VLGR1突变还可导致Usher综合征和癫痫。本实验室早期研究表明,VLGR1可在其蛋白水解位点(GPS位点)自水解成两部分:α亚基、β亚基;其中β亚基(Vβ)可与Gαi偶联来抑制腺苷酸环化酶(AC酶)的活性。综上可知,VLGR1在听觉系统发育中对维持听纤毛形态和听觉信号转导都发挥极其重要的作用。尽管目前VLGR1相关研究已取得重要进展,但其介导的细胞内信号转导分子机制及致病机理仍知之甚少,其蛋白结构也无人报道。目前已知的VLGR1剪接本共有8种,本论文以其中一种剪接本VLGR1a为研究对象,为防止VLGR1a水解,我们将其GPS位点突变,并命名为Va。本论文首先在Va第三个胞内环(ICL3)分别插入细胞色素b562-RIL(BRIL)、T4溶菌酶(T4L)来辅助研究受体结构,结果发现Va ICL3-BRIL和Va ICL3-T4L融合蛋白在Hek 293细胞中的表达并不理想。接着我们分别构建了昆虫细胞表达系统的Va与Gαi、Vβ与Gαi相关融合蛋白,在昆虫sf9细胞中大量表达后纯化得到足量且高均一性的蛋白样品,最后采用冷冻电镜技术来研究受体与G蛋白复合物的结构。目前我们已得到Va-Gαi融合蛋白,在负染电镜下初步观察到长条状受体颗粒存在,应为Va N端含calx-β域的胞外部分,从负染二维平均结果可看到受体不同的状态,但仍需提高其表达量和均一性。此外,我们将表达较高的Vβ-Gαi2与Gβ/cherry-Gγ做复合物,并在冷冻电镜下观察到复合物的形成,从冷冻二维平均结果可看到复合物的不同形态,还可看到未形成复合物的部分受体单体和受体二聚体。由于冷冻电镜技术对样品的浓度、纯度和均一性的要求较高,我们还需对蛋白的表达纯化条件及复合物形成条件进行优化。总之,目前的实验结果为解析VLGR1三维结构奠定了基础,这将在很大程度上推进其功能机制方面的研究,同时有助于开发出治疗耳聋的药物。
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