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背景与目的细胞液泡蛋白质分选因子4 B(vacuolar protein sorting 4B,VPS4B),参与溶酶体降解途径,细胞内蛋白质运输,病毒体出芽,以及调节有丝分裂和细胞分裂的不同阶段。本课题组此前发现VPS4B为牙本质发育不良I型(Dentin dysplasia type Ⅰ,DD-I)有关致病基因之一,并通过初步研究阐述VPS4B基因在牙齿发育过程中的功能作用。本课题组起初通过构建Vps4b基因敲除小鼠模型以探讨Vps4b基因对牙齿发育的影响以及相关调控通路。然而在小鼠配种繁殖过程中,发现Vps4-/-胚胎期致死,因此本课题组探讨其胚胎致死性机制,为进一步理解该基因在生物生长发育中的功能奠定基础。材料与方法通过RT-PCR、qRT-PCR、免疫组化检测小鼠Vps4b基因的时空表达。运用CRISPR-Cas9系统构建Vps4b基因敲除小鼠模型,通过PCR和Sanger测序鉴定小鼠基因型。RT-PCR、TA克隆、Sanger测序验证小鼠转录本,利用序列处理在线工具包(SMS)生物软件预测蛋白质变化情况,通过qRT-PCR、免疫组化对小鼠Vps4b基因的表达水平变化进行进一步验证。绘制出生后的小鼠体重生长曲线,通过定点交配Vps4b+/-小鼠以确定Vps4b-/-小鼠胚胎期致死时间,利用体视镜和HE染色观察Vps4b-/-小鼠胚胎致死形态。转染VPS4B野生型真核表达载体和VPS4B-siRNA至人源胚胎肾细胞HEK-293T,通过CCK-8检测过表达组及敲降组的细胞增殖状况,流式细胞术检测敲降组的细胞凋亡和细胞周期情况,利用qRT-PCR检测敲降组及E12.5天胚胎的细胞周期、细胞凋亡和细胞内吞相关靶基因的表达水平。结果RT-PCR、qRT-PCR、免疫组化结果发现小鼠Vps4b基因在不同时期、不同组织广泛且较稳定表达。Sanger测序显示成功构建Vps4b+/-基因敲除小鼠模型,RT-PCR、TA克隆、Sanger测序显示Vps4b+/-小鼠出现新转录本,SMS软件预测Vps4b+/-小鼠产生截短蛋白,qRT-PCR、免疫组化显示Vps4b+/-小鼠的Vps4b基因转录水平及蛋白水平显著降低。统计发现Vps4b-/-小鼠胚胎期致死,出生后的小鼠体重生长曲线显示Vps4b+/+与Vps4b+/-小鼠体重无明显差异,定点交配Vps4b+/-小鼠发现Vps4b-/-小鼠在E9.5天死亡,体视镜发现E9.5天后的Vps4b-/-胚胎严重发育迟缓并逐渐被母体吸收,HE染色显示E12.5天Vps4b-/-胎盘存在发育异常、血管明显减少等缺陷。CCK-8结果显示过表达或敲降VPS4B显著促进或抑制HEK-293T细胞增殖。流式细胞术检测发现敲降VPS4B导致HEK-293T细胞早期凋亡增加,且细胞停滞于G0/G1期,进入S期细胞明显减少。qRT-PCR检测发现敲降组和E12.5天胚胎的细胞周期、细胞凋亡和细胞内吞部分相关靶基因的表达水平有明显差异。结论Vps4b基因敲除导致Vps4b-/-小鼠在E9.5天致死,初步阐明细胞内吞通路缺陷和信号转导失调是胚胎致死的原因。表明Vps4b是小鼠早期胚胎发育必不可少的基因,为先天性畸形的预防和基因治疗提供了一定的理论基础和技术支持。