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目的:乳腺癌被认为是影响女性生命健康的恶性肿瘤之一,尽管在治疗上已经取得了很大进展,但多药耐药(MDR)仍然是乳腺癌患者死亡的主要原因。临床上现有化疗药物及耐药逆转剂虽然已应用多年,但是仍无法克服不良反应较多、作用靶点相对单一的缺点,所以寻找到一种作用温和、不良反应少、具有多靶点的新型药物,对提高临床治疗疗效是至关重要的。补骨脂素作为补骨脂的主要提取物之一,有文献报道在经过补骨脂素干预后,能降低MCF-7/ADR对阿霉素的耐药性,而且具有作用广泛、天然低毒等特点,但是具体机制尚未清楚。本实验通过补骨脂素处理乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADR后,检测P-gp的活性、表达变化和小窝蛋白-1的表达变化,及二者的共定位变化,并探讨其意义。此项研究有助于完善补骨脂素的抗肿瘤理论以及为补骨脂素作为多药耐药逆转剂的开发与利用提供理论依据。方法:1.在含有阿霉素的RMPI-1640完全培养基中培养MCF-7/ADR乳腺癌耐药细胞株。2.通过比较阿霉素对MCF-7/ADR和补骨脂素处理后的MCF-7/ADR两种细胞的50%抑制率(IC50),以此来检测补骨脂素对MCF-7/ADR的逆转作用。3.用BALB/c裸鼠进行乳腺癌造模实验,分组干预后,测量肿瘤体积大小,并用免疫组化技术检测心脏、肝脏和肾脏的病理变化。4.检测P-gp ATP酶活性及动力学分析。5.用Western Blot和RT-PCR技术检测不同浓度补骨脂素对P-gp表达的影响,免疫组化检测补骨脂素对裸鼠肿瘤组织中P-gp表达的影响。6.用显微荧光技术检测P-gp对ADR和Rh123的外排作用的影响。7.用Western Blot和RT-PCR技术检测不同浓度补骨脂素对小窝蛋白-1表达的影响,免疫组化检测补骨脂素对裸鼠肿瘤组织中小窝蛋白-1表达的影响。8.用免疫荧光技术检测MCF-7/ADR中小窝蛋白-1和P-gp共定位的影响。结果:1.通过比较IC 50值测量MDR细胞MCF-7/ADR对化疗药物的化学敏感性。逆转倍数值=MCF-7/ADR+补骨脂素的IC50/MCF-7/ADR的IC50。结果显示,MCF-7/ADR+补骨脂素和 MCF-7/ADR 的 IC50 分别为 24.28±1.53 μ g/ml 和 75.32±2.52 μ g/ml,逆转倍数值为 3.1 倍(p<0.05)。2.补骨脂素处理后的小鼠肿瘤体积明显小于对照组,并且补骨脂素处理后的小鼠心脏、肾脏和肝脏均为发现显着损伤。3.RT-PCR和Western Blot检测结果表明补骨脂素对mRNA和蛋白质水平的P-gp表达的没有影响(p>0.05);肿瘤样本免疫组化结果分析表明,补骨脂素干预后,P-gp的表达没有变化(p>0.05)。4.免疫荧光结果显示,与对照组相比,补骨脂素处理后的MCF-7/ADR中的ADR和Rh123积累明显增加。5.Western Blot和RT-PCR检测结果表明,与对照组相比,当用0,8,12,16mg/L补骨脂素处理MCF-7/ADR细胞后,小窝蛋白-1的表达水平明显下降(p<0.05);肿瘤样本免疫组化结果分析表明,补骨脂素干预后,小窝蛋白-1的表达明显降低(p<0.05)。6.免疫荧光检测结果显示,在MCF-7/ADR组中红色荧光小窝蛋白-1和绿色荧光P-gp叠加后,细胞膜区域出现黄色荧光,证明P-gp与小窝蛋白-1存在共定位关系。但在补骨脂素处理后的MCF-7/ADR组中,小窝蛋白-1的分布变得分散。并且在红色荧光小窝蛋白-1和绿色荧光P-gp叠加后,细胞膜区域的黄色荧光明显降低。MCF-7/ADR+补骨脂素的相对荧光强度为28.49%±1.03,显着低于MCF-7/ADR组51.09%±1.31。二者相比,补骨脂素处理后细胞的相对荧光强度降低了 0.56倍(p<0.05)。表明补骨脂素破坏小窝蛋白-1和P-gp的共定位关系。结论:1.补骨脂素显着逆转了MCF-7/ADR的耐药性。2.补骨脂素能够降低MCF-7/ADR异种种植裸鼠肿瘤的体内生长,并且在有效浓度下不会引起肝、心、肾等器官的毒性损伤。3.补骨脂素对P-gp表达的没有影响。4.补骨脂素降低了P-gp的药物外排转运活性。5.补骨脂素降低了小窝蛋白-1的表达。6.补骨脂素破坏小窝蛋白-1和P-gp的共定位关系。