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肝癌是最为常见的人类恶性肿瘤之一,尤其在亚非人群之中,肝癌发病率很高。临床研究显示,肝癌对放化疗不敏感,迄今为止,人类对肝癌仍然没有行之有效的治疗手段。另外,有越来越多的实验证据表明,肝癌就像乳腺癌一样,是一个性激素依赖的癌症。性激素受体如:雌激素受体,雄激素受体,孕激素受体等在肝癌发生发展过程中起重要作用。MicroRNAs (miRNAs)是一种大小约21-23个碱基的非编码单链小分子RNA,在生物体内发挥重要作用,包括细胞增殖,凋亡,应激反应和肿瘤发生。最近研究显示miRNA在多种肿瘤中的表达水平发生了变化,提示其可能在某些肿瘤的发生中发挥了重要作用。研究认为miRNAs水平的变化将导致其靶基因的表达异常,从而影响肿瘤的进程。许多肿瘤都涉及到了miRNAs的变化,并且其变化程度还与肿瘤的分型分级以及预后密切相关,这提示我们miRNAs可能能够作为肿瘤治疗的新型分子靶标。MiR-26a是一条重要的抑癌基因,在肝癌肿瘤组织中呈现高表达。并且运用腺相关病毒载体介导miR-26a高表达对肝癌小鼠模型有很好的治疗效果。但是研究中使用的腺相关病毒以及EF1α启动子缺乏肿瘤特异性,并且容易导致机体免疫反应,在治疗同时给机体造成很大的副作用。肿瘤特异性启动子如:hTERT (human telomerase reverse transcriptase)、hAFP (human alpha fetoprotein)在介导下游基因肿瘤特异性表达时是非常有效的。但是与其它强启动子相比,单个特异性启动子的转录活性非常低,而有研究报道串联启动子调节区可以增强其转录活性。目前对hAFP与hTERT启动子介导miRNA表达尚无报道,另外对于miR-26a抑制肿瘤生长的机制还不是很清楚。鉴于以上两点本课题的主要研究内容是:1、构建hAFP与hTERT双启动子介导的miR-26a特异性表达质粒;2、检测hAFP与hTERT双启动子能否有效介导miR-26a在肝癌细胞中特异性高表达;3、从细胞水平及动物水平验证hAFP与hTERT双启动子介导miR-26a的抑癌效果;4、探索miR-26a抑制肝癌细胞生长的新靶点、新机制。我们通过分子克隆的方法构建miR-26a肿瘤特异性表达质粒,Realtime PCR检测其在肿瘤细胞和正常细胞中的表达量差异,应用流式细胞仪,cck-8试剂盒,裸鼠皮下成瘤实验检测特异性表达质粒的抑癌效果,并且引入双荧光素酶报告基因实验探索miR-26a的未知靶基因。我们的实验结果显示,hAFP与hTERT双启动子可以介导miR-26a在肝癌细胞中特异性表达,并且特异性抑制肝癌生长的同时对正常肝细胞没有显著影响。此外,高表达miR-26a显著抑制ERα(estrogen receptor-α),cyclin D2,cyclin-E2, PR (progesterone receptor)蛋白表达量,深入研究,我们首次证实ERα是miR-26a的一个直接靶基因,高表达miR-26a可以有效抵制E2 (Estradiol)对肝癌细胞的促增殖作用。由此可见,hAFP与hTERT双启动子介导miR-26a特异性表达可以为肝癌基因治疗提供新的方法与思路。