癌症由于其逐年迅速攀升的高致病率及死亡率,严重威胁着人们的生存健康及生活质量。肿瘤免疫治疗作为随现代生物技术进步,应运而生的第四种肿瘤治疗方式,由于其良好的治疗效果,得到广泛关注。肿瘤基因疫苗具有制备简单,成本低、安全性高等特点,成为研究最为广泛的肿瘤免疫治疗方式。但肿瘤基因疫苗作为含有抗原、能够诱导机体免疫反应、产生特异性免疫、从而杀伤肿瘤的生物制剂,其长期稳定性及安全性是非临床研究的主要内容。对于肿瘤疫苗的非临床安全性研究,不仅要评价急性毒性试验、重复给药毒性试验、过敏试验等毒理学角度涉及的安全性内容,还必须通过组织分布,定量研究药物在生物体内吸收、分布、代谢和排泄规律,从药代动力学角度提供理论支撑。本课题组,前期已构建以双顺反子为载体、两种肿瘤相关抗原survivin和MUC1为免疫原、CpG基序和IL-2为免疫佐剂的DNA疫苗CpDV-IL2-sPD1/MS,并且已完成BALB/c小鼠肌肉单次注射给药毒性试验、豚鼠全身主动过敏试验、家兔肌肉注射刺激性试验,为疫苗的临床应用提供了毒理学相关参考数据。基于以上前期研究基础,本论文将继续完成非临床安全性检测的组织分布及药代动力学研究,从定量分析的角度,为疫苗临床应用提供支撑。首先对质粒标准品CpDV-IL2-sPD1/MS进行序列分析,针对序列特点特异性设计引物,而后以质粒标准品及小鼠基因组DNA分别为模板,进行Q-PCR反应,分析CT值结果并考虑后续实验进行可行性,综合分析,确定选择引物IL-2(Y)继续进行后续实验。在确定引物后,进行方法学的建立,包括对引物浓度、引物退火温度、反应体系DNA载量等相关内容优化。在方法学建立过程中,主要采用单一变量法,始终以质粒标准品为模板,以灭菌水为阴性对照,进行梯度试验,确定了Q-PCR的反应体系,其中最适引物浓度为200 nM、引物最适退火温度为60℃、反应体系最大DNA载量为0.2 ug。而后对方法学从线性及线性范围、准确度、精密度、灵敏度等方面进行验证。确立质粒标准品在10~2-10~8拷贝/反应范围内建立的标准曲线,具有良好线性,线性系数(R~2)大于0.99,PCR反应扩增效率在0.9-1.1之间,且检测方法对质粒标准品灵敏准确,相对回收率在50%-200%之间,RSD小于20%,灵敏度为62.5拷贝/ug genome。综上,完成整体方法学的建立与验证。提取给药后不同时间点的小鼠基因组DNA,运用建立并验证的方法学,进行Q-PCR反应,对组织样品中四个取样时间点的768例实验样品进行绝对定量分析。从组织分布结果可见,疫苗在给药后,首先在注射部位及血液中被检测到,而后在所选取的十六个组织部位均有分布,最后在脑组织中仍有少许残留。由此,可判断疫苗注射后,在体内的代谢呈快速吸收与分布,缓慢消除的特点。综上,本论文完成了课题组研制的DNA疫苗CpDV-IL2-sPD1/MS的非临床安全性检测中组织分布及药代动力学研究,首次采用Q-PCR法,对组织样品中疫苗含量进行绝对定量分析,进一步证实了疫苗的安全性,也提供了下一步探讨研究的主要方向,为疫苗进入临床试验阶段,提供了科学、可靠的理论依据。