背景肾功能衰竭常见于各种原因引起的以肾单位损伤为基础的疾病,如肾炎、肾缺血、急性肾损伤、慢性肾病等[1,2]。虽然,肾移植是现在临床上治疗肾功能衰竭最有效的方法,然而移植之后,好发的慢性移植性肾病却又变成了新的问题。肾缺血再灌注损伤(renal ischemia reperfusion injury, RIRI)是慢性移植性肾病中的一个重要原因,RIRI可以导致组织、细胞的坏死,炎性细胞的渗出、浸润,以及最后形成纤维化[3-5],致使肾功能下降。因此,在肾移植的过程中,如何降低RIRI是减少以肾间质纤维化为基础的慢性移植性肾病的关键。瞬时阳离子通道亚家族7 (transient receptor potential melastatin 7, TRPM7)是具有双重功能的蛋白质[6,7],它既是钙离子、镁离子、锌离子等二价阳离子通道,也是一类激酶。和大部分钙离子通道一样,TRPM7可以由缺血、缺氧等刺激激活,激活TRPM7可以导致钙离子内流增加,钙离子超载。大量的内流钙离子又可以刺激活性氧化物(reactive oxygen species, ROS)的产生,进而导致细胞的死亡。然而,当其他钙离子通道由各自阻断剂阻断时,TRPM7通道的激活依然存在,它独立于其他通道之外,不受影响[8]。研究表明,在细胞内高表达TRPM7时,细胞内的ROS和一氧化氮(nitric oxide,NO)水平明显增加,同时丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPKs)凋亡信号通路也被激活[9]。最近的研究发现,除了钙离子之外,镁离子也具有通过调节TRPM7改变细胞内的ROS、细胞应激等功能[10]-MAPKs(p38, ERK-1/2以及 JNK)是细胞的凋亡和增殖中重要的信号通路,而ROS和钙离子也是缺血再灌注损伤中最为重要的调控因子之一。细胞内ROS的上调,可以激活多种凋亡途径、刺激线粒体释放细胞色素C等破坏蛋白质、脂质以及DNA[11]。而细胞缺氧时,细胞表面的离子通道被激活,细胞内的钙离子,镁离子超载可以刺激ROS和NO的生成,从而导致细胞的死亡。在脑缺血的研究中发现,TRPM7参与了神经元的损伤,由激活的TRPM7介导的钙离子超载和ROS、NO上调导致了海马神经元细胞的死亡[8,12]。抑制大鼠海马中TRPM7的表达可以明显改善这种缺血再灌注损伤[13]。然而,TRPM7是否参与了RIRI,表达的位置在哪里?在RIRI中,TRPM7是否也具有同样的作用和机制?通过改变肾组织中TRPM7的表达,是否可以减少移植过程中的RIRI和远期的组织纤维化?第一部分TRPM7在大鼠RIRI中表达水平和表达位置的研究目的：检测大鼠RIRI中,TRPM7表达水平的变化以及变化的主要位置。方法：SD大鼠麻醉后,背部两侧做切口,切除右侧肾脏,然后以动脉夹夹闭左侧肾动脉45分钟后放开,关闭切口；分别于术后1 h、12 h、24 h、48 h、72 h、96 h取出缺血再灌注损伤的大鼠肾脏；提取肾脏组织总mRNA和总蛋白,进行聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)和western blot检测；以4%中性甲醛固定肾脏组织,进行以免疫组化为基础的量子点检测。实验分组：对照组为未经过RIRI处理的正常大鼠(10只)；实验组为经过RIRI处理的大鼠,缺血后不同时间点各组均为10只大鼠。结果：PCR的结果显示,TRPM7在大鼠肾脏中存在表达,在RIRI 24小时内,TRPM7表达量明显升高,1 h、12 h、24 h的表达量分别为正常肾脏的2.83、3.16以及3.95倍。Western blot也表现出同样的趋势。在量子点结果显示,TRPM7在RIRI后1h的大鼠肾脏中荧光值增强,增强的TRPM7主要定位于肾小管的上皮细胞。结论：TRPM7在RIRI早期表达水平上调,变化可能主要定位于肾小管上皮细胞。第二部分研究TRPM7在肾小管上皮细胞缺氧／复氧损伤中的作用及相关机制目的：明确TRPM7在肾小管上皮细胞NRK-52e缺氧／复氧损伤中的作用以及其相关的机制。方法：构建含有TRPM7-shRNA的慢病毒质粒,筛选出稳定低表达TRPM7的NRK-52e细胞株；以NRK-52e细胞建立细胞缺氧／复氧模型；以荧光探针检测细胞内钙、镁离子、ROS等含量。以western blot检测MAPKs、Bax等信号通路的表达变化。以CCK-8检测细胞的增殖情况。实验分组：对照组1为未转染任何质粒NRK-52e细胞,对照组2为转染空载质粒NRK-52e细胞(Vector-Control细胞,简称Vector-C细胞)；实验组为转染M7shRNA的NRK-52e细胞(NRK-52e-M7shRNA细胞,简称M7shRNA细胞)。结果：在细胞缺氧复氧后,M7shRNA组,细胞中相对钙离子浓度(Rel. Ca2+:0.488±0.04倍,vs NRK-52e, Vector-C, P< 0.05, n= 6)和相对镁离子浓度(Rel.Mg2+:0.443±0.09倍, vs NRK-52e, Vector-C, P< 0.05, n= 6)水平明显低于NRK-52细胞(Rel.Ca2+:1.06±0.04倍；Rel.Mg2+:1.0 ±0.04倍)以及Vector-C组细胞(Rel. Ca2+:1.04 ±0.06倍；Rel.Mg2+:1.04 ±0.11倍)。在经过缺氧/复氧损伤后,细胞内的ROS水平明显上调,然而M7shRNA组上调的幅度还是小于NRK-52e组和Vector-C组(Rel.ROS,M7shRNA vs NRK-52e, Vector-C:1.73 ±0.41倍vs 3.96±0.66倍,4.13±0.59倍,P<0.05,n=6)；在缺氧／复氧之前,M7shRNA组细胞内,ROS依然也明显低于NRK-52e组和Vector-C组(Rel. ROS, M7shRNA vs NRK-52e, Vector-C:0.45 ±0.08倍vs 1.03±0.05倍,1.07±0.15倍,P<0.05, n= 6)。 MAPKs信号通路结果显示,磷酸化p38和磷酸化JNK在M7shRNA组明显降低,而磷酸化ERK则明显升高,同时总蛋白并没有明显的差异,凋亡蛋白Bax在M7shRNA组也同样表达下降。细胞CCK-8增殖实验结果显示,在经过缺氧复氧损伤后,M7shRNA细胞活性明显高于NRK-52e细胞和Vector-C细胞。结论：通过降低细胞TRPM7的表达,可以减少缺氧/复氧中细胞的凋亡和死亡；TRPM7的作用可能是通过降低细胞内的钙离子、镁离子以及ROS水平。第三部分TRPM7在同种异体肾移植模型中的作用和机制的探讨目的：研究TRPM7在小鼠同种异体肾移植中的作用并探讨可能的机制方法：用肾包膜下微量注射技术在小鼠肾包膜下注入含M7shNRA质粒的慢病毒,构建肾脏低表达TRPM7的小鼠,并通过免疫组化为基础的量子点技术来验证；构建小鼠的同种异体肾移植模型后于术后24 h、48 h、72 h、7d、21 d时间点收集标本；每个时段都检测血肌酐,移植后24 h采用免疫组化检测移植肾脏的肾脏损伤蛋白-1 (kidney injury molecule-1, Kim-1),移植后48 h采用H&E染色检测肾小管坏死并评分,移植后72 h采用原位末端标记法(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling assay, TUNEL)检测肾小管凋亡,移植后7d采用免疫组化检测α-平滑肌肌动蛋白(a smooth muscle actin, a-SMA),移植后21d采用Masson染色检测肾脏纤维化。实验分组：正常组为未经过肾移植的小鼠；对照组1为磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution, PBS)组(即供体肾脏包膜下注射同等计量的PBS缓冲液),对照组2为Vector-C组(即供体肾脏包膜下注射了含空载质粒慢病毒的小鼠)；实验组为M7shRNA组(即供体肾脏包膜下注射了含M7shRNA质粒慢病毒的小鼠)。第三部分正常组、PBS组、Vector-C组和M7shRNA组均为6只小鼠。结果：通过量子点技术可以发现,包膜下微量注射技术可以有效降低小鼠肾脏TRPM7的表达。肾移植后48 h结果显示,实验组Kim-1的面积明显小于PBS组和Vector-C组；H&E染色发现TRPM7低表达的肾脏中,实验组肾小管的坏死评分低于PBS组和Vector-C组(1.75 ± 0.35 vs 3.24 ±0.34、3.25 ±0.35, P<0.05, n=6)。肾移植后72 h, TUNEL显示M7shRNA可以减少移植后肾脏凋亡细胞的生成(M7shRNA组vsPBS组,Vector-C组：17.67 ± 2.52 vs 59.33 ±7.02,59.67 ±4.16, P<0.05, n= 6)肾移植后7d, α-SMA的免疫组化显示,实验组在肾小管间质中的表达量明显低于PBS组和Vector-C组。移植后21d的Masson染色也反映同样的趋势(M7shRNA组vs PBS组,Vector-C组：14.3±1.95 vs 24.5±3.66,29.1±3.22,P<0.05,n=6)。血肌酐结果显示,移植后实验组小鼠的肾功能也一直优于对照组1和2。结论：通过降低肾脏TRPM7的表达可以在移植早期减少RIRI,远期减少间质纤维化,保护肾功能。TRPM7作用的机制可能是在移植过程中,通过减少Kim-1, α-SMA的产生,降低肾间质的纤维化,从而减少肾脏损伤。