目的:　　1.不同剂量咖啡因慢性干预作用对小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎的影响及其分子免疫学机制。　　2.不同阶段咖啡因干预作用对小鼠EAE发病的影响。　　3.咖啡因慢性干预作用对A2aR敲除小鼠EAE的影响，进一步明确咖啡因慢性干预抑制EAE发病的作用机理。　　方法与内容:　　SPF级C57BL/6小鼠（野生型及A2aR敲除基因型）小鼠:雌性，8-10周龄，体重16～20g。　　实验一:野生型小鼠40只，随机分为5组（每组8只）:①CFA阴性对照组;②EAE阳性对照组，③咖啡因饮水干预组(1mg·kg-1，10mg·kg-1，30mg·kg-1)。所有EAE模型组小鼠用MOG35-55混合CFA制成抗原乳剂皮内注射，CFA阴性对照组以生理盐水代替抗原肽制备“抗原乳剂”皮内注射，0、48小时腹腔注射PT造模。咖啡因干预自造模前10天起至EAE造模后第20天与对照组小鼠同期处死为止。自免疫当日定为第0天，每日两次观察并记录动物行为学及体重的变化。采用量化评分法，比较不同咖啡因剂量干预下EAE发病率、潜伏期、症状评分。实验动物处死后取大脑及腰髓组织制作石蜡标本，用H&E染色观察评价中枢炎症细胞浸润和损害程度。同时用逆转录-聚合酶链反应(reverse transcriptase polymerasechain reaction，RT-PCR)法测定小鼠大脑干扰素-γ(interferon-γ，IFN-γ)、白介素-17(interleukin-17，IL-17)和转化生长因子β(transforminggrowth factorβ，TGF-β)及腺苷受体(adenosine receptor，AR) A1R、A2aRmRNA的表达。　　实验二:野生型小鼠42只，野生型小鼠42只，以EAE免疫当天定为第0天，至免疫后第20天统一处死小鼠。在EAE发病不同阶段分别给予30mg·kg-1的咖啡因干预:①EAE阳性对照组（10只），无咖啡因干预;②-10天～20天全程干预组(8只)，③-10天～0天干预组（8只），④0天～10天干预组（8只），⑤10天～20天干预组（8只），⑥CFA阴性对照组（6只）。EAE制模及观察方法同实验一。记录EAE发病率、潜伏期、症状评分。取大脑和腰髓组织制作石蜡标本，用H&E染色观察评价中枢炎症细胞浸润和损害程度，用免疫组织化学法检测中枢神经系统小胶质细胞的离子钙结合受体分子1(ionized calcium-binding adaptor molecule1，Iba-1)表达。用RT-PCR法测定小鼠IFN-γ、IL-17、TGF-β及A1R、A2aR mRNA的表达。　　实验三:野生型小鼠20只，A2aR敲除基因型小鼠20只，分组如下:①野生型CFA阴性对照组（4只），②野生型CFA咖啡因干预组（4只），③野生型EAE阳性对照组（6只），④野生型EAE咖啡因干预组（6只），⑤A2aR敲除CFA阴性对照组（4只），⑥A2aR敲除CFA咖啡因干预组（4只），⑦A2aR敲除EAE阳性对照组(6只)，⑧A2aR敲除EAE咖啡因干预组（6只）。使用30mg·kg-1咖啡因干预自造模前10天起至EAE造模后第20天与对照组小鼠同期处死为止。EAE制模及观察方法同实验一。记录EAE发病率、潜伏期、症状评分。取大脑和腰髓组织制作石蜡标本，用H&E染色观察评价中枢炎症细胞浸润和损害程度，用Luxol Fast Blue(LFB)髓鞘染色检测中枢髓鞘脱失情况，用免疫组织化学法定量分析中枢神经系统小胶质Iba-1表达。用RT-PCR法测定小鼠IFN-γ、IL-17、TGF-β及A1R、A2aR mRNA的表达。　　结果:　　1.慢性咖啡因干预组EAE病情严重程度降低，最大神经功能评分下降，中枢炎症细胞浸润程度下降，病理评分降低，促炎因子IL-17、IFN-γ表达降低，抑炎因子TGF-β表达上升。　　2.经咖啡因干预后，-10天～20天（全程）、10天～20天（发病期）干预组小鼠日均神经功能评分低于EAE阳性对照组，与EAE组相比全程组最大神经功能评分下降、10天～20天（发病期）干预组发病潜伏期延长(P＜0.05)，10天～20天（发病期）干预组发病小鼠炎症细胞、小胶质细胞浸润相对较轻，咖啡因-10天～20天（全程）干预组炎症细胞、小胶质细胞浸润程度为最轻，多分布于脊膜周围，病理评分-10天～20天（全程）干预组较EAE阳性对照组有统计学差异(P＜0.05)。-10天～20天（全程）、10天～20天（发病期）干预组小鼠促炎因子IL-17低于EAE阳性对照组(P＜0.05)-10天～20天（全程）组小鼠IFN-γ表达亦降低(P＜0.05)，-10天～20天（全程）、10天～20天（发病期）干预组小鼠抑炎因子TGF-β高于EAE阳性对照组(P＜0.05)，同时-10天产～20天（全程）、10天～20天（发病期）干预组小鼠A1R表达相对较高(P＜0.05)。　　3.引入A2aR敲除基因型小鼠进行EAE制模，经咖啡因干预后发现:无论野生小鼠还是敲除小鼠，咖啡因干预组均比对照组潜伏期延长(p＜0.05)，最大神经功能学评分野生型咖啡因干预组低于野生型EAE组，A2aR敲除型小鼠咖啡因干预亦低于敲除EAE组(p＜0.05)。咖啡因干预组小胶质细胞浸润较EAE阳性对照组轻，髓鞘脱失状况也较轻。促炎因子检测显示咖啡因干预组IL-17、IFN-γ低于EAE阳性对照组(p＜0.05)，A2aR敲除EAE咖啡因干预组抑炎因子TGF-β表达高于A2aR敲除EAE阳性对照组(p＜0.05)。AR检测显示咖啡因干预组A1R的表达均较相应的EAE阳性对照组高(p＜0.05)。　　结论:　　1.咖啡因慢性干预对EAE有一定的的保护作用，这一保护作用以30mg·kg-1的高剂量组最为显著。咖啡因慢性干预可以上调A1R的表达含量，可能主要是通过上调A1R而发挥对EAE的保护作用。　　2.-10天～20天（全程）干预组、10天～20天（发病期）干预组咖啡因减轻EAE的病情主要是通过上调A1R来实现;10天～20天（发病期）干预组咖啡因干预的A1R上升，在-10天～0天（造模前期）干预组、0天～10天（潜伏期）干预组未观察到，提示咖啡因的上调A1R主要在EAE疾病发病期起作用（治疗作用而非预防作用）。　　3.咖啡因对A2aR敲除基因型小鼠EAE仍出现一定的保护作用，证明这一保护作用主要是通过A1R来实现的，而非A2aR。咖啡因作为非特异腺苷受体拮抗剂，在发病期慢性干预致A1R功能上调，A1R上调可以使促炎因子IL-17、IFN-γ释放减少，同时抑炎因子TGF-β释放增加，减少小胶质细胞的细胞毒性，对炎症细胞浸润、继发性脱髓鞘等起负调作用，减轻EAE病情，可能是咖啡因慢性处理能减缓EAE的作用机制。