论文部分内容阅读
迄今为止,周围神经缺损的修复仍然是临床外科领域尚待解决的疑难问题之一。如果两断端距离过远则影响再生轴突的生长。临床上常用神经移植进行修补,虽然传统的自体神经移植方法效果最好,但因为材料来源的限制而制约了它的应用范围;而同种异体神经移植又由于免疫排斥、移植成功率低等原因而难以推广。20世纪以来,神经组织工程研究的发展,尤其是由支架材料和细胞外基质、种子细胞以及诱导和促进生长的因子等几个部分组成的“组织工程神经”的构建为人们寻找神经代用品修复周围神经缺损带来了新的希望。Schwann细胞是神经组织工程中最重要、也是最常使用的种子细胞。但由于自体Schwann细胞来源有限且不容易增殖;而异体的Schwann细胞又会引起免疫排斥反应,因此将Schwann细胞化的“组织工程神经”应用于临床的研究仍遇到难以逾越的障碍。骨髓基质细胞（bone marrow stromal cells MSCs）因取材方便,来源广泛,在一定培养条件下可迅速大量扩增,具有自我更新、活跃增殖和多向分化潜能,且自体移植克服了伦理和免疫排斥等问题,作为一种理想的种子细胞脱颖而出。近年来一些在体外的研究证明MSCs在给予合适的诱导条件下,可以表达神经元的标记。这些研究表明MSCs在诱导分化后形态上发生了类似神经元的形态变化并且可以表达神经细胞的特异性蛋白,所以这些研究者认为是MSCs向神经细胞发生了转分化。但是也有持不同观点的报道,有研究者认为MSCs在体内的分化是与宿主的神经系细胞发生融合的过程。有的研究认为MSCs并没有真正的分化,而细胞形态的改变仅是由于诱导剂的化学性刺激的作用引起细胞的收缩和细胞骨架的塌陷。因此,目前关于MSCs是否有潜能分化成神经系的细胞是当今干细胞研究领域中的一个热点问题。我们以前的研究证明了大鼠的MSCs移植到坐骨神经受损的部位后,在体内有一部分能够分化为Schwann细胞样细胞并且表达S100蛋白,MSC移植到体内是有利于神经的再生。为了进一步分析MSC在向Schwann细胞分化的过程中Schwann细胞标记蛋白S100蛋白是否真正发生了表达变化,我们的实验探讨大鼠骨髓基质细胞在体外诱导的过程中,MSCs的形态变化以及表达Schwann细胞的标记蛋白S100B蛋白的变化。我们从成年SD大鼠的股骨和胫骨中分离培养MSCs。采用MTT法检测细胞的活力,FCM检测细胞周期和CD分子等方法研究MSCs的特性。结果证明MSCs在体外易扩增,传1—8代以内的细胞增殖能力无明显变化。未经诱导的MSCs大部分处于G0/G1期,G0/G1期的细胞所占百分比平均高于80%;骨髓基质细胞CD29（+）,CD11b（-）,CD90（+）。本实验应用复合诱导因子BME,RA,FSK,bFGF,PDGF,HRG体外连续诱导MSCs向Schwann细胞样细胞分化。诱导分化后采用免疫荧光细胞化学染色,流式细胞仪,Western Blot和逆转录PCR方法分别检测检测Schwann细胞的标记蛋白S100蛋白及其mRNA的表达。结果发现诱导分化后的MSCs形态上发生了类似Schwann细胞样细胞的变化。MSCs在诱导过程中S100的mRNA有上升的趋势;通过免疫荧光方法观察到诱导后MSCs表达S100蛋白增强;我们又通过Western Blot和流式细胞仪进一步定量检测到MSCs表达S100蛋白增高。又因为大多数的研究观察了细胞形态以及几种神经相关蛋白的免疫反应,也有报道用基因组学方法分析MSCs诱导过程中基因谱的表达变化。目前尚未见报道用蛋白质组学方法分析MSCs在诱导过程中蛋白谱的表达变化。我们进一步利用蛋白质组学技术分析MSCs向Schwann细胞样细胞诱导分化过程中蛋白谱的表达变化。我们采用2-DE技术分离未诱导和诱导分化过程中MSCs总蛋白,应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱得到相应的肽质量指纹图谱,搜索数据库分析差异蛋白质点。我们所得到的MSCs蛋白谱有792±23个蛋白点,通过PDQuest软件分析未诱导MSCs蛋白谱和诱导分化过程中MSCs蛋白谱,初步分析发现有74个蛋白质的表达发生了明显的变化（p＜0.05）,其中43个蛋白表达上调,31个蛋白表达下调。我们通过质谱分析并进行网上数据库搜索匹配,初步分析发现这些蛋白主要包括骨架和结构蛋白（tubulin alpha,vimentin,brain-specific alpha actinin 1 isoform等）、生长因子类的蛋白（ciliary neurotropic factor,brain-derived neurotrophic factor等）、代谢相关蛋白及酶类（UDP-glucose dehydrogenase,eph and elk-related kinase等）、伴侣蛋白（heat shockprotein等）、受体类蛋白（Laminin receptor 1,Ly49 stimulatory receptor 3等）、细胞周期蛋白（p27,RAS p21 protein activator 1等）、钙结合蛋白（nucleobindin 1,non musclecaldesmon等）以及其它蛋白等。总之,我们的实验结果表明MSCs在诱导分化后形态上发生了类似Schwann细胞样细胞的变化。未经诱导分化的MSCs表达少量S100蛋白,MSCs在这种体外条件诱导分化的过程中表达S100蛋白有明显的增加,而且在诱导分化过程中S100mRNA的表达有上升的趋势。MSCs体外条件诱导分化过程中有较多蛋白表达发生变化;其中与神经细胞和神经胶质细胞相关蛋白:BDNF,CNTF,ILGF,pleiotrophin,FGF,GFAP,synaptophysin等在MSCs体外条件诱导分化过程中表达明显上调;本研究从蛋白质水平为MSCs体外向Schwann细胞样细胞条件诱导提供了新的研究资料。