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近年来,随着测序技术和组学研究的发展,人们根据肿瘤的基因和蛋白表达特征对肿瘤进行了精确地划分并制定了个性化的治疗方案,同时这也推动了肿瘤新生抗原疫苗的研究。许多的动物肿瘤模型和临床试验都已证明肿瘤新生抗原疫苗的安全性和有效性,它可以诱导机体免疫系统产生特异性抗肿瘤免疫反应,因此肿瘤新生抗原被认为是精准治疗肿瘤的重要靶标。目前已有许多关于准确预测新生抗原的文章发表,同时也有许多的公司通过测序和软件预测的方法为患者选择新生抗原,但是临床结果表明软件选择的新生抗原肽引起的免疫响应率普遍偏低。这主要是因为抗原肽在细胞内的递呈过程复杂,预测算法简单地线性叠加不能准确预测抗原肽能否被主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex,MHC）分子递呈。此外,已经积累的抗原肽数据量依然达不到机器学习所需要的量,导致软件不能准确预测抗原肽的免疫原性。因此,我们需要构建一套实验筛选新生抗原肽的方法,在软件预测的基础上结合实验找到强免疫原性的新生抗原肽作为疫苗的候选位点,提高肿瘤新生抗原疫苗激活抗肿瘤免疫反应的有效性。与此同时,DNA疫苗具有制备周期短、储存条件简单、经济有效等优点,在未来可广泛应用于预防性和治疗性肿瘤疫苗。但直接裸DNA注射给药激活的免疫效应不够理想,因此我们需要设计一个合理的载药平台,在保证安全性的同时,提高DNA疫苗的体内递送效率。我们选择了小鼠黑色素瘤细胞株B16F10和C57BL/6小鼠作为我们研究肿瘤新生抗原DNA疫苗安全性和有效性的对象。由于不同人之间存在基因背景差异、MHC多态性和抗肿瘤免疫反应多样性等问题,鲜有文章报道小鼠肿瘤模型个体之间是否也存在类似的差异,以避免该差异的存在对药效一致性评价的影响。因此我们首先对从C57BL/6小鼠接种B16F10细胞株获得的皮下黑色素瘤和肺转移黑色素瘤的全外显子组和转录组测序数据分析,结果表明不同的C57BL/6小鼠个体间遗传背景相似,不同个体不同组织来源的黑色素瘤组织中相同的突变在总突变中占比65.1%,但不同个体产生的抗肿瘤免疫反应表现差异较大,如抗肿瘤免疫反应信号通路的激活、肿瘤浸润的免疫细胞、趋化因子的表达等。排除了不同小鼠个体来源的黑色素瘤异质性较大的可能,随后我们对B16F10细胞株和黑色素瘤组织共有的突变在现有的软件算法基础上进行了预测分析,并通过设定突变频率、RNA表达量、突变抗原肽与MHC亲和力高于野生肽等条件进一步缩小实验筛选新生抗原肽的范围,提高筛选效率。为了提高新生抗原肽在小鼠骨髓来源树突状细胞（bone marrow-derived dendritic cells,BMDC）表面被MHC I类分子递呈的量,我们在编码新生抗原肽的DNA前添加了kozak-signal peptide-ubiquitin（KSU）序列,流式检测结果表明KSU序列的添加有助于提高新生抗原肽被MHC I分子递呈到BMDC细胞表面。在该基因设计的基础上,我们通过体外细胞实验证明了软件预测得到的54条新生抗原肽中的10条能够激活T细胞更强的杀伤B16F10细胞的能力。此外,我们还探究了质谱技术检测肿瘤细胞表面递呈的抗原肽序列。为了提高DNA疫苗激活的抗肿瘤免疫反应效力,我们设计了短基因串联序列（tandem minigene,TMG）和TMG-IL12共表达两种DNA疫苗,体外细胞实验表明TMG-IL12共表达形式的DNA疫苗可以更有效地刺激树突状细胞（dendritic cell,DC）成熟,激活T细胞分泌更多的IFN-γ和Granzyme B,对B16F10细胞的杀伤能力也更强。此外,我们还制备了DOTAP和DOTAP-DOPE两种形式的脂质体包裹DNA疫苗,减少其被体内核酸酶降解的可能性,凝胶电泳结果表明当脂质体与质粒在N/P比为10:1时可以有效地保护质粒不被DNase I酶降解,肿瘤细胞转染结果也表明在该比例条件下脂质体与质粒室温混合20min形成的纳米复合物转染效率最佳。当脂质体给药浓度为100μg/m L时,脂质体对BMDC细胞几乎无毒性。与此同时我们还探究了免疫佐剂Cho-Cp G ODN的最佳使用浓度,以提高DC细胞摄取脂质体-DNA纳米复合物的概率,结果表明当Cho-Cp G ODN浓度为0.2n M时（纳米复合物所用质粒为5μg）,24小时内BMDC细胞对脂质体-DNA/Cp G纳米复合物的摄取量相比脂质体-DNA纳米复合物更高。最后,在小鼠皮下黑色素瘤模型中,我们探究了不同疫苗给药剂量对肿瘤的抑制效果,结果表明低剂量（5μg/只）给药可以有效抑制皮下黑色素瘤的生长,促进肿瘤组织中CD8+T细胞和中性粒细胞的浸润,且高剂量（50μg/只）的脂质体-DNA/Cp G纳米复合物未对小鼠机体产生明显毒性。我们在小鼠皮下黑色素瘤模型和肺转移黑色素瘤模型中比较了D-TMG/Cp G、D-TMG-IL12/Cp G、DD-TMG/Cp G和DD-TMG-IL12/Cp G四种形式的DNA疫苗抑制皮下黑色素瘤生长和肺转移灶形成的效果,结果表明四种形式的DNA疫苗均能很好地抑制黑色素瘤的生长和转移,并延长皮下荷瘤小鼠的寿命,其中DD-TMG-IL12/Cp G形式的DNA疫苗抑制黑色素瘤肺转移灶形成的效果最佳。此外,D-TMG-IL12/Cp G和DD-TMG-IL12/Cp G相比其他两种DNA疫苗给药刺激小鼠淋巴结中CD4+T和CD8+T细胞增殖比率更高。本研究构建了一套实验筛选肿瘤新生抗原的方法,细胞和动物实验均证明了肿瘤新生抗原DNA疫苗的安全性和有效性,为肿瘤新生抗原的筛选制定了新方法,为DNA疫苗的设计提供了新思路,为肿瘤新生抗原DNA疫苗的研发奠定了基础。