研究背景甲状腺相关眼病(Thyroid associated ophthalmopathy, TAO)是一种与甲状腺自身免疫疾病密切相关的眼部疾病,常伴随着Graves’病(Graves’disease,GD)发生,临床上又称为Graves眼病(Graves ophthalmopathy, GO),其眼部表现具有显著的特征：轻者仅有眼部不适、眼睑退缩；重者出现突眼、复视,甚至视力丧失。目前还没有令人满意的治疗方法。TAO发病机制尚不完全明了,较公认的为“共同抗原学说”,即眼外肌膜成纤维细胞与甲状腺交叉抗原表达,导致眶内活性淋巴细胞浸润,释放各种细胞因子,作用于眼眶组织,引起眼眶的炎症反应,同时刺激成纤维细胞分泌糖胺聚糖(Glycosaminoglycans, GAG),大量亲水性GAG堆积继而导致眼球突出等一系列临床症状,其中TSHR可能作为主要交叉抗原在TAO发病机制中起重要作用。球后成纤维细胞、淋巴细胞及其分泌的细胞因子在TAO的发生、发展中发挥了关键作用,也成为目前较为公认的发病机制所在。之前的研究证实不同分期TAO外周血和球后组织中细胞因子的表达具有差异性,活动期显著升高的细胞因子IL-6、TNF-α等可在一定程度上评判眼病活动分期。作为甲状腺相关眼病中受累组织之一的泪腺,在发病及眼病进展中的作用目前尚不明确。影像学及病理学研究证实,TAO患者泪腺肿大,泪腺组织淋巴细胞浸润和脂肪增生,与球后组织病理改变相似。Eckstein等发现正常泪腺腺泡细胞表面表达促甲状腺素受体(Thyroitropin receptor, TSHR),而TSHR是导致甲状腺和眼眶发病的重要交叉抗原。由此,研究者提出假说,泪腺腺泡细胞可能是TAO发病中的靶细胞之一临床上,TAO患者的眼表症状突出,包括结膜充血水肿、流泪或泪液分泌减少、干涩异物感等,与干眼症相似,亦有研究证实TAO患者泪膜破裂时间缩短,眼表疾病指数升高,干眼症状明显,引起临床医生和学者们的重视。既往的研究认为眼表症状的出现与眼球突出度增加、睑裂增宽,泪液蒸发加速导致泪液渗透压增加相关,但是近来的研究证据显示可能泪腺也参与TAO的干眼症状的发生。泪腺是眼分泌性免疫系统的主要组织,含有多种淋巴细胞和免疫活性成分,对眼表的保护作用和免疫功能的发挥主要依靠分泌泪液实现。泪液中含有复杂的细胞因子成分,可调节多种细胞功能,其浓度变化可引起一系列炎症反应,导致干眼等眼表症状,可作为疾病恢复的信号和干眼症等眼表疾病的标志物。泪腺腺泡细胞与球后成纤维细胞表面同样表达TSHR,并出现与活动期球后组织相似的病理改变,由此,我们提出假设：泪腺是否与球后组织一样存在细胞因子网络的失衡?而作为泪腺分泌物,泪液细胞因子水平是否可以间接反映泪腺炎症反应和眼病活动性?目前国内外此类研究极少,甲状腺相关眼病患者泪液细胞因子表达情况尚不明确。对TAO患者泪液细胞因子谱的研究有助于进一步从非创性角度去初步探讨泪腺在甲状腺相关眼病发病中的作用,对不同活动分期TAO细胞因子浓度的比较,有助于寻求活动分期的可能指标,为临床治疗提供可靠依据。液相芯片是基于美国Luminex公司xMAP(flexible multianalyte profiling)技术的新型芯片技术平台,具有高通量、高灵敏度、高特异性的特点,非常适合于同时检测微量泪液样本中的多个细胞因子。对多个细胞因子水平进行检测与评价比检测单个细胞因子更能反应疾病发生与发展的整体变化。本研究将应用液相芯片技术分析不同活动分期TAO泪液中IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ、IL-17、IL-8、和IP-10的水平,了解TAO患者泪液细胞因了的表达情况。并随访观察球后放射治疗前后各细胞因子水平的变化,进一步探讨泪腺、泪液炎症因子在TAO发病机制中的可能作用,并寻求甲状腺相关眼病活动分期的可能指标。研究目的利用液相芯片技术检测不同分期TAO泪液中5种细胞因子和2中趋化因子水平,了解TAO患者泪液细胞因子的表达情况,并寻求活动分期的可能指标。研究方法1、研究对象：连续收集2011.01-2012.02在南方医院内分泌科和南方医科大学第三附属医院内分泌科就诊的近3个月内未行大剂量激素冲击和其他免疫抑制剂治疗的中重度TAO患者47例,按CAS评分标准将其分为活动期27例(CAS≥3)和稳定期20例(CAS<3)；同期连续收集正常对照组10例。收集非刺激性泪液,采用LiquiChipTM液相芯片技术检测泪液中IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ、IL-17、IL-8和IP-10的水平2、统计方法：采用SPSS13.0统计软件进行数据分析。符合正态分布的计量资料以X+SD表示,偏态分布的计量资料以中位数表示。正态分布的各组间计量资料的分析采用One-way ANOVA,当P≥0.05时,认为方差齐,用LSD法作进一步的多重比较。方差不齐性时,用Welch法校正,并用Dunnett T3法进一步作多重比较。偏态分布的计量资料和等级资料的组间比较采用非参数检验,三组间泪液细胞因子浓度比较采用Kruskal-Wallis H检验,P<0.05为差异有统计学意义,进一步组间比较采用Wilcoxon符号秩检验,检验水准采用校正后P值,以P<0.017为差异有统计学意义。TAO患者中泪液细胞因子与促甲状腺素受体抗体(thyrotropin receptor antibody,TRAb)和CAS评分的相关性分析用spearman相关分析,P<0.05为差异有统计学意义。研究结果1.TAO与正常人泪液细胞因子表达情况细胞因子IL-6、趋化因子IP10、IL-8在所有57份标本中取得结果(检出率为100%),浓度范围分别为0.32～1583.15pg/ml、58.26～19404.08pg/ml、6098.18-24034pg/ml。TNF-α和IL-10在54份标本中检出(检出率为94.7%),浓度范围分别为0.25～121.23pg/ml、0.33～108.82pg/ml。IL-17仅在1例标本中检出(检出率为1.8%),IFN-γ在所有的标本中均未检出.2、TAO组与正常人泪液细胞因子浓度比较与正常组相比较,TAO患者泪液IL-6、IL-10、IL-8和IP-10水平显著升高,差异具有统计学差异(P<0.001P=0.046P=0.002P=0.026),而TNF-α在TAO和正常组间无显著差异(P=0.664)3、不同TA0分组间泪液细胞因子浓度比较IL-6：与正常组比较,活动期TAO组和稳定期TAO组泪液IL-6浓度均明显升高,差异有统计学意义。(P<0.001P=0.003),活动期TAO组和稳定期TAO间比较,差异具有统计学意义,活动期TAO组IL-6显著高于稳定期TAO组(P=0.001<0.017)。IL-10：与正常组相比较,活动期TAO泪液IL-10浓度显著升高,差异有统计学意义(P<0.001)；活动组与稳定组比较差异具有统计学意义,活动期TAO IL-10浓度显著高于稳定期TAO(P=0.009)；稳定期TAO组与正常组间比较差异无统计学意义(P=0.705)TNF-α：与正常组相比较,活动期TAO组和稳定期TAO组泪液TNF-α浓度无显著差异(P=0.353P=0.555),活动期TAO组与稳定期TAO组比较,差异具有统计学差异(P=0.006)IL-8：与正常组相比较,活动期TAO泪液IL-8浓度显著升高,差异有统计学意义(P<0.001)；活动组与稳定组比较差异无统计学意义(P=0.017)稳定期TAO组与正常组间比较差异无统计学意义(P=0.044)IP-10：与正常组相比较,活动期TAO泪液IP10浓度显著升高,差异有统计学意义(P=0.004)；活动组与稳定组比较差异具有统计学意义,活动期TAOIP10浓度显著高于稳定期TAO(P=0.004)；稳定期TAO组与正常组间比较差异无统计学意义(P=0.307)4、TA0患者泪液细胞因子与CAS、TRAb的相关TAO患者泪液IL-6、IL-10、TNF-a、IL-8、IP10与活动性评分CAS呈不同程度相关性(r=0.565,0.415,0.453,0.385,0.469；P<0.001,0.005,0.002,0.008,0.001)TAO患者泪液IL-6、TNF-α、IL-8、IP10与TRAb浓度呈不同程度相关性(r=0.477,0.325,0.314,0.365；P=0.002,0.032,0.032,0.012),IL-10浓度与TRAb无显著相关(P>0.05)结论1、甲状腺相关眼病影响泪液细胞因子水平,与正常人比较,TAO患者泪液细胞因子IL-6、IL-10、IL-8和IP10显著浓度升高。2、不同活动分期TAO泪液细胞因子表达具有差异性,活动期TAO泪液IL-6、IL-10和IP10浓度显著高于稳定期,并与眼病活动性评分CAS呈正相关,泪液IL-6、IL-10和IP10浓度在一定程度上可作为活动分期的评判指标。研究目的纵向观察并比较甲状腺相关眼病患者泪液中5种细胞因子和2种趋化因子水平在球后放射治疗前后的变化,旨在了解其动态变化,进一步明确泪液细胞因子在判断眼病活动分期中的意义。材料与方法1.研究对象：第一章中活动期TAO组中接受直线加速器球后放射治疗、并完成治疗后3个月随访的14例TAO患者,男2例,女12例,平均年龄(39.00+11.17)岁。治疗后3月收集非刺激性泪液,采用LiquiChipTM液相芯片技术检测泪液中IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ、IL-8、IP-10和IL-17的水平2.治疗方法球后放射使用美国VARIAN2100C型直线加速器。分次照射剂量为200cGy,总剂量2000cGy(10次/2周),在模拟机下定位,照射野大小一般为4cmx4cm,机架角度偏转3°～5°,以避开对侧晶体,疗程为2周。治疗开始时同时口服强的松30mg,1/日,治疗结束后逐渐减量至停药。3.临床相关指标所有入组患者完成治疗前和治疗3月后临床活动评分(CAS),NOSPECS分级、突眼度及睑裂宽度测量,同时抽血进行甲状腺功能和TRAb的检测。CAS、突眼度、睑裂宽度的测定由2名指定的专业人员独立完成,测量结果意见一致。4.统计方法：采用SPSS13.0统计软件进行数据分析。计量资料以X+SD或者中位数表示。治疗前后CAS、突眼度、睑裂宽度和TRAb浓度比较采用配对t检验,治疗前后泪液细胞因子浓度比较采用两相关样本非参数检验,P<0.05为差异有统计学意义。研究结果1、球后放射治疗前后临床指标比较与球后放射治疗前比较,治疗后3月后CAS评分、TRAb、睑裂宽度和突眼度均显著下降,差异具有统计学意义(P<0.001P=0.001P=0.005P=0.009)见表2-12、治疗前后泪液细胞因子浓度比较治疗后TAO泪液细胞因子IL-6浓度显著下降,差异具有统计学意义(P=0.041)其余细胞因子IL-10、TNF-α、IL-8和IP10浓度无显著下降(P=0.950P=0.074P=0.096P=0.510)结论1、球后放射治疗后TAO泪液IL-6浓度显著下降。机制可能为球后放疗减轻泪腺淋巴细胞浸润和细胞因子IL-6的合成分泌,从而降低泪液IL-6的浓度。2、球后放射治疗后TAO患者眼病活动性评分、突眼度和睑裂宽度显著下降,证实球后放疗是治疗活动期中重度TAO的有效方法,