腈类化合物是现代工业生产中常用的原料或中间物质,可广泛应用于有机溶剂、塑料、橡胶以及医药行业。然而,腈类化合物又是一种在环境中残留时间较长、具有较大潜伏性危害的有机氰化物,在其大量生产和持续应用的过程中所产生的含腈废水未经处理或处理不彻底排放已导致环境的污染。由于此类污染物中的大部分腈类化合物,如乙腈、丙烯腈、丁烯腈等具有高毒性、致癌性和致突变等特性,长期接触会引发一些人类疾病,造成水生动植物死亡,破坏生态环境。因此,研究开发实用、高效的含腈废水处理技术至关重要。目前在含腈废水处理方法中研究较多的有化学法、物化法和微生物法等,其中微生物法以其反应条件温和、成本低及环境友好等优点更为各方所接受。目前已筛选到一些高效降解菌株,然而关于这些菌株对腈类物质的降解途径及菌株代谢机理的研究却鲜有报道。另外,在利用移动床生物膜反应器(Moving Bed Biofilm Reactor,MBBR)法处理实际废水的应用中,有针对性的投加高效腈降解菌并促进其在载体表面的定殖是提高含腈废水处理效果的有效手段,但是由于降解菌自身通常具有较弱的成膜能力,难以附着于载体表面而流失,因此在投加降解菌的同时加入生物膜形成菌具有促进降解菌固定的作用。目前有关利用降解菌结合生物膜形成菌进行废水生物强化的研究仍有待深入开展。为了深入揭示高效腈降解菌对脂肪腈类化合物的降解机理及对含脂肪腈废水的生物处理效果,本论文从以下几个方面进行了具体研究,并获得结果如下:1.将高效腈降解菌Rhodococcus rhodochrous BX2分别接种于以乙腈、丙烯腈和丁烯腈为唯一碳氮源的无机盐培养基中,监测菌株的生长及对各种脂肪腈的降解情况,并通过一级反应动力学模型拟合降解动力学方程。结果显示,BX2可分别利用三种脂肪腈作为唯一碳、氮源及能源生长,且根据50%底物的消失时间(t12)进行评价,其对三种脂肪腈的降解效率从高到低依次为乙腈(2.95 h)>反式丁烯腈(6.86 h)>丙烯腈(11.11 h)>顺式丁烯腈(31.13 h)。2.利用气相色谱(GC)法和气质联用法(GC-MS)分别检测BX2对乙腈、丙烯腈和丁烯腈降解的中间产物,结果表明,其中间产物均为相应的酰胺和羧酸,因此初步认为BX2对三种脂肪腈可能通过共同的代谢途径——腈水合酶/酰胺酶和腈水解酶两条途径进行降解。同时,本研究分别以乙酸、丙烯酸和丁烯酸为唯一碳源,NH4Cl为唯一氮源分析BX2对各种羧酸的代谢情况,结果发现,BX2在各种培养基中均能良好生长,并且随着菌体密度增加,各种脂肪酸浓度逐渐降低,直至完全消失。这一结果进一步说明三种脂肪腈代谢所产生的相应羧酸可继续为BX2所降解,因此不存在中间产物对酶活性的反馈抑制作用。3.由于BX2可通过共同的代谢途径——腈水合酶/酰胺酶途径和腈水解酶途径对各种脂肪腈进行降解。因此本研究通过qRT-PCR方法对其相关酶系——腈水合酶、酰胺酶和腈水解酶在脂肪腈降解过程中表达量的动态变化进行分析。研究结果显示,腈水合酶和酰胺酶的mRNA水平均表现出相伴随的变化,即在腈降解的早期出现高峰然后下降;而相比之下,腈水解酶的mRNA水平较低且保持相对恒定。因此推断,腈水合酶/酰胺酶系统和腈水解酶系统均参与了 BX2对脂肪腈的降解过程,且腈水合酶/酰胺酶系统可能发挥主导作用。4.为进一步验证qRT-PCR结果的可靠性,确认腈水合酶/酰胺酶系统在脂肪腈降解中的重要作用,本研究通过测定无细胞酶液中酶活性检测腈水合酶、酰胺酶和腈水解酶在三种脂肪腈降解过程中的动态变化。结果表明,腈水合酶与酰胺酶的活性依然表现出相同的变化趋势,在腈降解的早期酶活性升高达到最高值,然后开始下降,而腈水解酶活性与之相比一直较低且相对恒定,这些结果均与mRNA水平的变化趋势相一致。因此,根据这三种酶在mRNA水平和酶活性变化趋势的一致性认为腈水合酶/酰胺酶系统是BX2降解脂肪腈的优势酶系。5.利用RNA-Seq技术对丁烯腈诱导培养的BX2菌株进行转录组测序,结果显示丁烯腈的存在使BX2中下调表达基因(353个)数量明显多于上调基因(194个),表明丁烯腈对于BX2而言仍然有一定毒性,细胞整体代谢水平下降,又通过上调某些基因表达而加强其对丁烯腈的代谢,适应这种生存环境。其中上调的腈水合酶基因有3个(分别上调3.91倍、3.31倍和1.78倍),所表达的腈水合酶包含了 Co3+型高分子量和低分子量两种类型;酰胺酶基因2个(分别上调3.91倍和2.43倍),水解酶基因1个(上调4.96倍)。该结果与前期研究认为腈水合酶/酰胺酶途径为脂肪腈降解优势途径的推断具有一定吻合性。我们还发现除了与腈降解有关的基因上调表达外,参与其它物质如苯酸盐、丙二酚、氯烷烃、氯烯烃、甲烷及丙酮酸盐等代谢的相关基因的表达也显著上调,暗示了 BX2具有广泛的底物谱,这对其在污染物生物修复中的实际应用具有重要意义。6.为进一步将菌株BX2应用于实际废水处理,本研究在单因素试验基础上,通过响应面方法中的Box-BehnkenDesign模型优化了 BX2对丁烯腈的降解条件。结果显示,当底物浓度为1019.71 mg/L,接种量为4.44%,温度为31.14 ℃,pH为7.17时,顺式丁烯腈的108 h降解率为88.70%,反式丁烯腈的10 h降解率为88.99%,分别比优化前提高了1.56%和1.71%。BX2对丁烯腈的耐受能力极强,可在1000～3500 mg/L范围内良好生长。外加碳源果糖、半乳糖、麦芽糖、葡萄糖、蔗糖、乙酸钠、柠檬酸钠和氮源乙酰胺、酵母膏、氯化铵、蛋白胨可不同程度促进BX2对丁烯腈的降解。7.为了以高效腈降解菌BX2为基础建立一种对含腈废水具有高效处理效率的生物处理体系,本研究将BX2与生物膜形成菌(M1和N4)合理组配,在确认生物膜形成菌对1000 mg/L丁烯腈具有耐受而无降解能力的前提下,进一步测定BX2与2株生物膜形成菌共培养后的生物膜量、BX2菌落数及顺、反式丁烯腈降解率。结果显示混合培养有利于生物膜形成及腈降解菌BX2的定殖,进而提高了对顺、反式丁烯腈的降解率。在此基础上,本研究将BX2与各种生物膜形成菌混合接种于丁烯腈合成废水中,培养72 h后检测不同组合细菌所形成生物膜对丁烯腈的生物降解能力,结果发现,BX2与不同生物膜形成菌混合培养比BX2单独培养对丁烯腈具有更强的抗冲击能力,其中,BX2+M1+N4组合对顺、反式丁烯腈的降解效率均高于其它组,分别为32.55-45.95%和67.55-80.95%,表明该组合更适合用于MBBR中进行含丁烯腈废水的处理。8.利用优化后的MBBR运行参数(水力停留时间为24 h、曝气强度为0.4 m3/h、填充比为30%)处理含丁烯腈废水。结果显示,反应器运行28 d时,投加活性污泥+BX2+生物膜形成菌的R4反应器出水中反式丁烯腈完全降解;运行60 d后,出水中顺式丁烯腈的浓度由600mg/L降为41.79±2.15 mg/L,COD浓度由 880.16mg/L降为 53.58±1.05mg/L,处理效果明显优于其它组。对载体生物膜的检测结果显示,R4反应器的生物膜量和腈降解菌的定殖量均高于其它组,其中红球菌丰度为投加BX2的R2反应器的2.82倍。而且BX2定殖使生物膜微生态系统发生改变,微生物群落多样性和具有腈降解作用的微生物丰度显著增加。同时腈水合酶和腈水解酶基因表达量均显著升高,分别为投加活性污泥反应器生物膜的55.51倍和29.18倍,表明优化后的生物膜微生态系统通过提高腈水合酶和腈水解酶表达而强化了对丁烯腈的降解能力。以上结果显示通过此种方式建立的多物种生物膜在含脂肪腈废水处理中具有高效性,今后可尝试将这种污水处理方式应用于其它的废水处理系统。