论文部分内容阅读
蛇皮果（Salacca zalacca （Gaertner） Voss ex. Vilm.）为棕榈科（Palmae）蛇皮果属（Salacca）果树，原产于马来半岛至爪哇一带，引进我国已有20多年历史。有性繁殖是蛇皮果繁殖的重要方式，然而有性繁殖的蛇皮果苗木难以从形态上区分其性别，用实生苗造林时无法对雌雄比例进行合理配置。有鉴于此，本文通过RAPD分子标记技术找出了与蛇皮果性别相关的雄性特异性片段并转化为SCAR标记，从而实现了蛇皮果的早期性别鉴定。研究结果不仅可用于鉴别蛇皮果实生苗的性别，还可与种胚组培技术相结合形成蛇皮果雌苗快繁技术体系，为实现按需提供雌雄苗木提供技术支撑，改变现有雌雄混杂造林带来的局限。因此，本研究对于提高我国蛇皮果栽培水平具有重要意义。1、以蛇皮果新鲜叶片为材料，测试CTAB法、SDS法、CTAB-free法和改良CTAB法等4种蛇皮果基因组DNA提取方法，结果表明：改良CTAB法能有效地去除酚类物质、多糖和蛋白质的干扰，是蛇皮果基因组DNA的有效提取方法。2、以上述提取方法提取的蛇皮果基因组DNA为材料，通过调节Mg2+浓度、dNTPs浓度、Taq DNA聚合酶浓度以及退火温度观测反应产物的电泳效果，结果表明：PCR扩增体系为15μL：10×buffer1.5μL，0.12mmol/L dNTPs，0.12U/μL Taq DNA聚合酶，1.4mmol/L Mg2+，1.0μmol/L RAPD引物，12ng DNA模板。PCR扩增程序为：94℃预变性2min；再40个循环：94℃变性30s，39℃退火30s和72℃延伸2min；最后72℃延伸10min。3、利用上述1和2确定的方法，以蛇皮果‘Pondoh’品种雌雄株各10株为材料，筛选了900条随机引物，结果表明：只有引物S1431（序列：5’-CCTGGGTCAG-3’）产生了一条大小约为1600bp的雄性特异片段。利用S1431引物对同一蛇皮果林另外随机抽取的蛇皮果雌雄株各10株进行检测，所得结果相同，说明RAPD分子标记具有鉴别蛇皮果性别的可行性。4、对蛇皮果RAPD分子标记获得的雄性特异片段进行克隆和测序，结果表明：该特异性片段为一条1640bp碱基的序列，具体序列省略。5、根据测序所得的序列结果进行分析，设计出一对大小为18bp的SCAR标记引物LF（5’-AGCACAGCCTAGTTAGTT-3’）和引物LR（5’-TGACACCTCCTCCCATAT-3’），利用该对引物对12株营养生长期蛇皮果成年植株进行PCR反应，结合繁殖生长期观察，结果表明：有雄性特异片段的为雄株，没有雄性特异片段的为雌株。同时利用该对引物对20株蛇皮果实生苗进行PCR反应，结果表明：其中有8个样本得到与雄株相同大小的特异片段，另外12个样本没有任何片段。利用该对引物对7株‘GadingAuy’品种、4株‘Pondoh’品种和1株‘Bali’品种共12株蛇皮果种胚组培苗进行了PCR扩增，结果没有得到任何特异性片段。6、以种子数不同的果实育出的苗为材料，利用上述LF和LR引物进行分析，根据雄性特异片段的有无确定实生苗的雌雄，结果表明：一个果内具有2个种子和3个种子繁育出的群体雌雄比例为1:1；一个果内具有1个种子的雄性概率为80%；蛇皮果实生苗的总体雌雄比例为1:1。7、对含雄性特异片段的蛇皮果和不含雄性特异片段的蛇皮果的种子重量、苗木叶总长度和根总长度进行比较，结果表明：两组各性状之间不存在显著差异，表明难于通过这些性状鉴别实生苗性别。8、对蛇皮果雌雄株早期性别鉴定基因组DNA提取、PCR反应、电泳和人工等费用进行了计算分析，结果表明：一批次只测定1个样品时单株性别鉴定所需费用为18.00元；而一批次测定96个样品时性别鉴定所需费用为150元，大大小于通过穴植3株的栽植方式，表明其具有经济可行性。