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背景与目的:干细胞治疗以及以干细胞为载体的基因治疗是目前医学领域的研究热点之一[1-7],如何对这些细胞的生物学行为进行实时、有效的活体示踪是干细胞治疗用于临床的必要前提,MRI因其具有较高的时间和空间分辨率而成为细胞活体示踪的最佳方法之一[8-11]。目前多数研究采用体外超顺磁性氧化铁标记的方法对移植细胞进行MRI示踪[12-17],但细胞内铁含量随细胞增殖逐渐减少是这一方法的主要缺陷,利用MRI报告基因成像有望解决这一问题。magA基因是一种存在于趋磁菌中并能介导磁小体形成的重要基因片段[18-22],有望作为一种理想的MR报告基因用于活体细胞的MRI示踪。本研究利用人工DNA合成技术获得magA基因,并以慢病毒为载体将magA基因转入293T细胞,初步研究其转铁效应,为进一步利用magA报告基因成像进行细胞移植的活体示踪奠定基础。方法:1 magA基因的人工合成、引物设计及鉴定根据基因库查询magA(1305 bp)全基因序列进行人工合成,并在其两端分别合成上下两条引物和2个限制性内切酶XbaⅠ和BamHⅠ识别位点。利用XbaⅠ和BamHⅠ酶切位点将合成magA序列连接入pUC57(2 710 bp)载体质粒多克隆位点(MCS)内,小提重组克隆质粒pUC57-magA并对其进行双酶切鉴定以及基因测序分析序列准确性。2重组慢病毒载体pLenti/GFP-magA的构建及鉴定提取pUC57-magA重组质粒和pLenti/GFP慢病毒空载体质粒,用限制性内切酶KpnⅠ和SmaⅠ对其双酶切,分别回收纯化,得到magA基因双粘片段和pLenti/GFP双粘线性质粒DNA片段,以DNA连接酶将二者连接,转化感受态细菌DH5a,接种含pLenti/GFP-magA重组质粒菌株于LB(Amp+)液体培养基,小提重组克隆质粒(pLenti/GFP-magA),酶切及基因测序鉴定阳性重组质粒pLenti/GFP-magA准确性。3慢病毒(包被magA基因)的制备、靶细胞感染及鉴定按慢病毒包装系统操作说明,将3种质粒(包装质粒、包膜质粒、重组载体质粒(pLenti/GFP-magA))共转染包装细胞293FT细胞,分别于48 h和96 h后在荧光显微镜下观察包装细胞荧光表达情况,并收取病毒上清,分装备用;然后以病毒颗粒感染293T细胞,以抗生素(氨苄青霉素)筛选获得GFP高表达率准细胞株293T/magA/GFP,行RT-PCR检测magA是否成功转入。4 magA基因的转铁效应检测在培养基内加入外源性铁(枸橼酸铁,500μmol/L)培养、传代准细胞株293T/magA/GFP至4代,同时设立对照组对比,荧光显微镜观察并提取每代部分细胞行普鲁士蓝染色、电镜显像、细胞体外MR成像,以检测magA的转铁效应,同时行台盼蓝排除试验检测细胞活力。结果:1 magA及重组慢病毒载体质粒的鉴定酶切和DNA测序分析证实magA基因已准确克隆入慢病毒表达载体质粒pLenti/GFP的设计位点,合成的目的基因序列与GenBank中magA序列完全一致。2 magA病毒颗粒的生产与感染荧光显微镜下观察包装细胞293FT细胞质内有大量绿色荧光表达,慢病毒颗粒感染293T靶细胞后,经多次传代细胞内持续稳定表达GFP,且效率>85%,RT-PCR证实magA已成功转入293T细胞核基因组且持续稳定表达。3 magA的转铁效应普鲁士蓝铁染色发现实验组细胞内有大量蓝染铁颗粒形成,电镜发现胞内有致密电子颗粒形成,体外MRI可见随着细胞量的增多MR信号明显降低。与实验组细胞相比,对照组均呈阴性表现。两组细胞台盼蓝拒染率无显著差异。结论:本实验对magA基因进行了人工合成;成功构建了携带磁共振报告基因magA的慢病毒表达载体;经过共转染293FT包装细胞生产了病毒颗粒,并以此病毒颗粒成功感染293T细胞,验证了magA基因的过表达;初步证实了magA基因在哺乳动物293T细胞内的转铁效应,为进一步利用magA基因进行细胞的活体示踪奠定了基础。