目的:恶性肿瘤是一种高发病率和高死亡率且严重危害人类健康的疾病,因此攻克和治愈肿瘤是人类科学研究的首要任务,而肿瘤的起源一直是人们所关注的重要问题。目前,已有大量的研究认为肿瘤源自于干细胞,提出这一观点的是干细胞成熟阻滞理论。本实验室前期已经建立干细胞分化阻滞实验模型,探索干细胞分化受阻对干细胞分化增殖的影响,发现干细胞分化受阻后可形成异质细胞簇进而形成肿瘤,为干细胞成熟阻滞理论提供了依据支持。但干细胞分化受阻形成肿瘤的假说,仍然需要探索和挖掘更多的科学证据。本研究利用双向热循环消减SELEX技术,从肝癌、胃癌、肺癌及健康人血清中筛选获得特异性较高的核酸适配体;利用筛选获得的核酸适配体,从肝癌、胃癌、肺癌及健康人血清中分别调取核酸适配体特异性结合的蛋白,然后利用生物信息学和蛋白组学等方法,研究获得的肿瘤患者和健康人血清蛋白组,以探讨肿瘤形成与干细胞分化进化的相关性。方法:1、以琼脂磁珠为载体,利用双向热循环消减SELEX技术筛选肿瘤患者血清和健康人血清特异性核酸适配体;通过高通量测序技术对获得的适配体进行测序;收集肝癌、胃癌、肺癌患者及健康人血清各50例,进行特异性验证研究。2、选取高丰度血清特异性结合适配体,分别从肝癌、胃癌、肺癌病人血清中调取适配体特异性结合蛋白组;采用LC-MS/MS质谱技术进行蛋白质组的非标记定量蛋白质组学(Lable-free)分析,并进行相对定量。3、通过生物信息学方法对靶标蛋白质组进行差异蛋白分析、GO功能注释、KEGG通路分析,构建肿瘤靶标蛋白质组相互作用网络,寻找肿瘤发病过程关键蛋白质。4、利用公共数据库验证肿瘤发病机制相关的关键蛋白质。利用软琼脂克隆形成实验验证关键蛋白在人肝癌(HepG2)细胞和肺癌(PC-9)细胞克隆形成过程中的作用。结果及结论:1、通过双向热循环消减SELEX技术筛选核酸适配体,分别获得了肝癌、胃癌、肺癌和健康人血清高丰度核酸适配体序列8条、14条、8条和10条。从上述高丰度适配体序列中分别选取5条合成,进行阳性检出率试验,结果依次为92%、90%、90%和88%。结果显示:分别获得肝癌、胃癌、肺癌及健康人血清特异性核酸适配体。2、利用合成的核酸适配体分别从肝癌、胃癌、肺癌及健康人血清中调取适配体特异性结合蛋白质组。通过Lable-free相对检测技术共鉴定得到肝癌、胃癌、肺癌和健康人血清依次有390、490、358和474个血清特异性蛋白质。通过差异蛋白生物信息学分析发现,三种肿瘤的上调蛋白质,其功能主要为脂质转运、微囊体和炎症反应等;下调蛋白质其功能主要为损伤修复、防御系统等。结果显示:当肿瘤发生后,肿瘤组织需要有大量的细胞产生和凋亡细胞的清除,需要脂质转运蛋白和微囊体分别运送细胞膜和细胞质的构成原料,同时机体通过炎症反应来清除凋亡细胞所产生的废弃物质;同样,下调蛋白反映肿瘤患者机体由于损伤修复、防御系统减弱,才使肿瘤发生成为可能。3、通过特异性蛋白质生物信息学分析,我们获得了肿瘤发生发展过程的关键蛋白质(如P36955和Q8N474蛋白质等)。关键蛋白是当细胞增殖到相互接触时,产生的反馈抑制调解蛋白,从而阻止干细胞的进一步分裂和分化,恢复静默状态。在肿瘤患者血清中关键蛋白是下调状态,使得调解干细胞增殖的反馈信号降低,造成干细胞增殖分化无法终止,从而产生干细胞的异常分化和无限增殖,形成肿瘤。4、采用两种方法对上述结果进行验证:(1)利用公共数据库验证肿瘤发病机制相关关键蛋白质,结果显示Serpinf1基因和sFRP1基因的表达均对肝癌和胃癌患者的生存影响具有统计学差异(p<0.05),对肺癌患者的生存影响无统计学差异(p>0.05)。(2)利用软琼脂克隆形成实验验证关键蛋白,分别进行P36955蛋白、Q8N474蛋白及Way-316606蛋白(Q8N474蛋白抑制剂)对肝癌HepG2细胞和肺癌PC-9细胞克隆形成的影响。结果显示,P36955和Q8N474蛋白均抑制细胞克隆的形成(p<0.05),Way-316606蛋白促进细胞克隆的形成(p<0.05),由此证明,P36955和Q8N474蛋白参与干细胞终止分化的反馈调节。结合蛋白质组学分析也更进一步证明,正常人机体损伤修复出现异常,才导致肿瘤的发生。