为了从环境微生物中开发更多的糖苷酶基因,使其在工业生产领域发挥重要应用价值,本研究采用基于基因序列的筛选方法从土壤宏基因组DNA中筛选α-糖苷酶同源基因。从数据库中下载已知的糖苷水解酶第13家族(GH13)的氨基酸序列构建系统进化树,分析查找保守区序列,利用Consensus-Degenerate Hybrid Oligonucleotide Primer (CODEHOP)在线引物设计软件设计一刘简并引物,以来源于不同地域的46个土壤宏基因组DNA为模板进行PCR扩增,得到23条α-糖苷酶同源基因,通过多序列比对,选取同源性在70%以上的2条序列(glu33、glu50)跟野生型糖苷酶全长基因xcg进行嵌合重组,获得了两条嵌合型的α-糖苷酶全长基因,命名为xcg-33和xcg-50,其核酸序列长度分别为1617bp和1629bp,分别编码539和543个氨基酸,蛋白分子量约为60KD。将这3个α-糖苷酶(xcg、xcg-33和xcg-50,下同)全长基因分别克隆到原核表达载体pET-28a载体上,转化至E. coli BL21(DE3)宿主菌中,加入0.1mM IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)在25℃下进行诱导,成功表达了具有生物酶活性的α-糖苷酶蛋白,并且可溶性蛋白表达量达到总蛋白量的35%以上以pNPG(对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷)为底物对3个α-糖苷酶的酶学性质进行表征,结果表明,XcG-33和XcG-50的比活是XcG的6-8倍。XcG-33，XcG-50和XcG的最适反应温度分别为35℃、40℃及40℃,最适pH分别为7.5,7.5,9.0。XcG-33的最适反应温度比另外两个酶低。嵌合型糖苷酶XcG-33、 XcG-50的最适反应pH比野生型糖苷酶XcG低,向中性pH偏移了1.5个pH值。这3个α-糖苷酶在30℃的水浴中孵育1h之后保持45-65%的相对剩余活力。5mM的Cu2+、Fe3+、Ni2+等金属离子能极大程度抑制3个糖苷酶活性,5mM的K+、Mg2+、Ca2+对α-糖苷酶活性影响不明显。3个α-糖苷酶对不同浓度有机溶剂的耐受性研究表明,正己烷对α-糖苷酶的活性没有抑制作用,反而有一定的促进作用。低浓度的DMSO和无水乙醇对3个α-糖苷酶的活性影响不大,随着浓度升高,抑制作用增强。戊二醛对α-糖苷酶的抑制作用最明显,低浓度的戊二_醛即可使其损失90%左右的活性。水解底物特异性实验结果表明,这3个α-糖苷酶能够水解具有α-1,4糖苷键的麦芽糖和乳糖,对具有其他糖苷键的天然糖没有水解活性。本实验对3个α-糖苷酶进行了转糖苷反应的研究,发现了该酶均具有转糖苷活性,可以利用一系列含羟基化合物作为糖基受体进行转糖苷反应,生成新的化合物。3个α-糖苷酶转糖苷的能力不同,能够催化的底物也不同。其中XcG-33的转糖苷能力相对其他两个酶转糖苷活性更高,底物更广泛,连续转糖苷能力更强。总的来说,我们使用基于数据库的序列筛选策略(简并引物PCR),从宏基因组DNA中成功获取了23条新的α-糖苷酶同源基因片段,结合交错PCR的方法,通过嵌合重组成功获取了2个α-糖苷酶完整序列。通过构建大肠杆菌异源表达体系,成功表达了α-糖苷酶蛋白并对其进行了酶学性质表征。3个α-糖苷酶在转糖苷反应的中存在差异,XcG-33的转糖苷能力相对其他两个酶转糖苷活性更高,底物更广泛,连续转糖苷能力更强,揭示了宏基因组筛选方法能够得到功能多样的新基因。对α-糖苷酶的初步研究表明该酶对一系列底物的转糖苷反应具有较高催化效率,证明了XcG-33和XcG-50是具有潜在应用价值的α-糖苷酶新基因。