CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated nuclease9,Cas9)是2013年应用的一种新的基因定点编辑技术,它可以定点修饰目标基因,因其操作方便、技术简单而被用于多个物种的基因组编辑研究,对于研究基因功能和进行作物分子设计育种具有重要价值。U3、U6启动子具有明确的转录起始位点,是CRISPR/Cas9基因编辑技术体系的重要元件。目前,棉花基因组测序已经完成,棉花二倍体基因组有多个U3和U6启动子,但是这些启动子能否都可以在CRISPR/Cas9体系中实现对棉花内源基因的编辑功能,目前还不是很清楚。为此本研究从两个方面开展工作,一方面是构建以Gb U6-1P、Gb U6-7P和Gb U3-2P为启动子驱动sg RNA,以负调控基因GGB为靶序列的CRISPR/Cas9基因编辑载体;另一方面是对构建好的基因编辑载体在棉花新海16叶片原生质体中进行功能鉴定。具体结果如下:(1)以负调控基因GGB为靶序列的CRISPR/Cas9基因编辑载体,采用酶切(HindⅢ、KpnⅠ和XbaⅠ)的方式进行鉴定,结果发现条带大小与预期设计大小一致,说明基于Gb U3-2P、Gb U6-1P和Gb U6-7P启动子的CRISPR/Cas9基因编辑载体均已构建成功,分别命名为Gb U6-1P::GGB-sg RNA-Cas9、Gb U3-2P::GGB-sg RNA-Cas9和Gb U6-7P::GGB-sg RNA-Cas9。(2)通过PCR方法大量富集构建好的CRISPR/Cas9基因编辑载体的核心片段,并利用PEG瞬时转化法将核心片段转入原生质体中,提取转化后的原生质体基因组DNA,采用酶切/PCR法分析棉花GGB基因的突变情况并测序验证。最后通过测序结果绘制靶基因突变的频率分布图来确认该CRISPR/Cas9系统的编辑效率及真实性。结果显示以Gb U3-2P、Gb U6-1P和Gb U6-7P为启动子的CRISPR/Cas9基因编辑体系均可以成功地定点编辑棉花内源靶基因的序列,引起基因突变,突变类型全部为碱基置换(包括转换和颠换两种类型),突变率分别为21%、34.5%和26%。