植物病毒病是仅次于真菌病害的第二大病害,严重危害重要的经济作物和粮食作物,并且危害程度逐年加重。随着基因工程的迅速发展,抗病育种成为防治病毒病的有效手段之一。其中应用最为广泛的是利用病毒的外壳蛋白(coat protein,CP)基因转化植物,使其获得抗性,这与病毒外壳蛋白基因组结构、功能及在细胞中的定位有一定的联系。不同病毒的CP在病毒的侵染过程中所起的作用不同,其在植物细胞中的亚细胞定位和引起植物产生的抗性也应该不同。因此,本文比较分析了本实验室目前所有的共计六种病毒的CP亚细胞定位及瞬时表达对植物的影响,以期为更详细的理解不同病毒CP在病毒致病中的作用及不同病毒CP在诱导植物产生抗性中的作用提供更多的依据。六种病毒分别是烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)、马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)、芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus,TuMV)、马铃薯X病毒(Potato virus X,PVX)、烟草曲茎病毒(Tobacco curly shoot virus,TbCSV)、烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)。本文根据Genebank中五种病毒外壳蛋白全长设计含酶切位点的引物,以RNA为模板,PCR扩增外壳蛋白全长,插入载体中间pSAT1-EGFP-C1或pSAT6-EGFP-N1上,利用PCR筛选及酶切鉴定得到中间重组载体质粒,再用PI-PSP I或ASC I单酶切,插入到最终植物表达载体pPZP-RCS1,同样利用PCR筛选及酶切鉴定得到含CP的重组克隆,用冻融法将重组克隆(其中TMV CP的植物表达载体已在本实验室前期完成)导入根癌农杆菌EHA105,菌液PCR及酶切鉴定证明质粒均已成功导入根癌农杆菌EHA105中。用根癌农杆菌介导的瞬时表达观察它们在本氏烟、云烟中的亚细胞定位,进行初步的比较分析。结果显示:不同的病毒CP在同种植株中的亚细胞定位存在差异性,如在本氏烟中PVX、PVY、TuMV、TMV外壳蛋白都存在于细胞质和细胞膜(或细胞壁)上,Tu MV、TMV、TRV外壳蛋白可进入细胞核;这几种病毒在细胞质中形成的结构也有差异,如:PVY、TuMV、TMV、TRV形成一些丝状结构,其中TMV、TRV丝状结构较多,而且TRV有泡囊结构,但PVX外壳蛋白在细胞质中则是形成较大的聚集体;而双生病毒TbCSV外壳蛋白与其他五种病毒明显不同,主要分布在细胞周边,以一些不连续小点分布在细胞壁上,细胞质中以多聚体的形式存在,在膜上聚集成小体。此外,只有PVX、TbCSV的外壳蛋白存在于叶绿体及气孔中。在云烟中的PVY、TbCSV与其在本氏烟中定位情况相同,而其他四种病毒有些不同,如:PVX、TRV外壳蛋白表达量都有所降低,TuMV表达量虽然仍较高,但GFP荧光强度减弱,而TMV外壳蛋白在叶片中的表达量显著增强;另外PVX主要分布在细胞膜上,形成较少的聚合体;TuMV细胞质中丝状结构较少,但形成的聚合体有所增加;TRV细胞质中丝状结构及囊泡结构明显减少。本实验室的前期工作中发现ToMV、TMV CP与烟草蛋白IP-L存在互作关系,为了进一步了解IP-L与ToMV CP互作是否存在特异性,本文在前期的基础上,利用根癌农杆菌介导的瞬时表达将构建好的CP与IP-L共注射,观察它们的共定位情况。结果表明PVX、TuMV、TRV、TbCSV CP与IP-L存在共定位,推测它们之间可能存在互作关系,而PVY CP与IP-L未观察到共定位情况。植物在受到病原物侵染后,植物体内的相关抗性水平会有所升高。为了了解CP对植株产生抗病性是否相关以及不同病毒间引起抗病性的差异性比较,本文对CP瞬时表达后的云烟叶片进行了防御酶(超氧化物歧化酶SOD、过氧化物酶POD、多酚氧化酶PPO、过氧化氢酶CAT)活性和叶绿素含量的测定。结果显示,防御酶活性在接种后五天都有不同程度的增强,所有处理组叶片中叶绿素a、总叶绿素、叶绿素a/b都明显降低,而叶绿素b除TMV CP处理组外,其他处理组也都减少。为了进一步说明CP对植物的抗病性有一定的影响,将成功瞬时表达六种外壳蛋白的本氏烟叶片接种TMV-GFP侵染性克隆,在UV紫外灯下观察TMV扩散情况。结果显示,六种处理组均明显抑制了TMV的侵染,说明CP诱导植株产生了一定的抗性。