水稻瘤矮病毒(Rice gall dwarf virus,RGDV)属于呼肠孤病毒科(Reoviridae)植物呼肠孤病毒属(Phytoreovirus),在介体电光叶蝉(Recilia dorsaliis)内属于持久增殖型病毒。植物呼肠孤病毒在介体叶蝉内完成侵染循回过程,需要克服多重组织屏障,包括中肠侵染屏障、中肠释放屏障、唾液腺侵染屏障和唾液腺释放屏障等。本研究主要针对RGDV在其介体电光叶蝉体内的复制和扩散过程以及由病毒侵染引起的细胞凋亡机制进行了研究。1.RGDV在电光叶蝉体内的侵染循回过程为了明确RGDV在介体内的侵染循回过程,本研究通过免疫荧光标记了RGDV侵染电光叶蝉不同时间后,病毒在其消化道系统的定位。首先将电光叶蝉饲毒2d,取出饲养于健康水稻幼苗。在饲毒后第2d,病毒在电光叶蝉的滤室处复制并组装成子代病毒粒体,从而确定了电光叶蝉的滤室上皮细胞是RGDV的初侵染点。饲毒后第5 d,子代病毒穿过基底膜扩散到滤室外层的肌肉组织,进而侵染中肠和后肠,此过程病毒可释放到血淋巴细胞。饲毒后第9 d,RGDV侵染电光叶蝉的整个消化道系统。结果表明RGDV在电光叶蝉体内的侵染和扩散过程为:病毒首先穿过中肠微绒毛进入滤室上皮细胞,经复制后穿过基底膜扩散到滤室细胞的外层肌肉组织,沿着环肌和纵肌侵染整个中肠和后肠并释放到血淋巴,最后侵染唾液腺。本研究首次直观地阐述了 RGDV在电光叶蝉消化系统的复制和扩散过程,进一步明确了持久增殖型病毒和多重传播屏障的生理关系,为解析病毒和介体屏障的互作机制奠定了基础。2.RGDV复制因子的功能鉴定植物呼肠孤病毒在介体细胞内可以诱导形成提供病毒复制和装配场所的球状或纤维状的电子致密内含体—病毒原质(viroplasm),是由非结构蛋白组成的。为了明确RGDV编码的非结构蛋白Pns7、Pns9和Pns12在RGDV侵染介体电光叶蝉培养细胞内的功能,本研究通过原核表达的Pns7、Pns9和Pns12蛋白免疫注射新西兰兔,制备蛋白的抗体,并应用免疫荧光标记和RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术研究三个蛋白在介体培养细胞内的定位和参与病毒原质的形成过程。共聚焦显微镜和透射电子显微镜观察到在病毒侵染的细胞内,Pns7、Pns9和Pns12蛋白的多克隆抗体能够特异地标记在病毒原质上。通过体外T7转录酶合成 Pns7、Pns9 和 Pns12 基因的双链 RNAs(double-strand RNA,dsRNAs),即获得dsPns7、dsPns9和dsPns12。分别在细胞内干扰Pns7、Pns9和Pns12基因的表达后,可有效地抑制病毒原质的形成和成熟、病毒粒体的装配和病毒编码蛋白的表达。表明Pns7、Pns9和Pns12作为病毒原质的组分参与了 RGDV在介体培养细胞内的复制。为了进一步验证Pns7、Pns9和Pns12在RGDV侵染介体电光叶蝉过程中的功能,利用显微注射系统分别将dsPns7、dsPns9和dsPns12注射到饲毒2 d的电光叶蝉体内,分别在饲毒后第4 d、10 d和15 d,解剖昆虫的消化道系统并进行免疫荧光标记。结果显不dsPns7、dsPns9和dsPns12处理的电光叶蝉体内,病毒仅在初侵染点滤室处积累,不能扩散到外层的肌肉组织,从而抑制了病毒释放到血淋巴和唾液腺,使其丧失了传播病毒的能力。这些研究表明Pns7、Pns9和Pns12在RGDV侵染电光叶蝉培养细胞和虫体过程中起复制功能。3.RGDV在昆虫培养细胞内扩散因子的鉴定RGDV在介体培养细胞内复制后,需要进行细胞内和细胞间的扩散。本研究通过免疫荧光标记技术和电子显微镜技术观察到病毒编码的非结构蛋白Pns11在草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda,Sf9)细胞和电光叶蝉培养细胞内能够形成丝状和管状结构。丝状结构主要分布于细胞质中,以成簇形式存在,病毒粒体紧密而规则的排列在丝状结构周围。管状结构包裹着病毒粒体,由侵染细胞的细胞膜表面伸向邻近健康细胞表面,推测Pnsl1形成的这种管状结构参与病毒在细胞间的扩散。为了验证Pns11在病毒扩散过程中的作用,本研究通过病毒抗体中和游离到细胞外的病毒观察病毒的扩散情况。结果显示病毒能借助于Pns11形成的管状结构从初次侵染的细胞扩散到邻近的健康细胞。体外合成Pns11基因的dsRNA(dsPns11),将其转染到培养细胞发现,dsPns11有效地抑制了管状结构的形成,阻碍了病毒在细胞间的扩散,而对病毒的增殖没有影响。表明Pns11形成的管状结构是RGDV在电光叶蝉培养细胞间能够扩散的关键因子。4.Gelsolin通过与Pns11互作负调控RGDV在电光叶蝉培养细胞的侵染应用酵母双杂交技术发现RGDV Pns11和电光叶蝉的Gelsolin存在特异性互作关系。Gelsolin在Sf9细胞内以弥散状分布在细胞质中。当Pns11和Gelsolin在Sf9细胞内共表达时,Pns11能够改变Gelsolin的结构,使其共定位在一起。在电光叶蝉培养细胞内Pns11和Gelsolin也能够共定位。这些结果表明Pns11与Gelsolin存在特异性互作。当在培养细胞内干扰Gelsolin基因的表达后,RGDV的侵染率明显上升,表明Gelsolin对RGDV起着负调控的作用。5.RGDV在电光叶蝉内引起的细胞凋亡有利于病毒在介体电光叶蝉内增殖RGDV侵染电光叶蝉培养细胞后,细胞发生皱缩和死亡现象。通过研究Pns11在细胞内的定位发现,Pns11丝状结构会定位到线粒体使其降解。同时还发现RGDV侵染后的电光叶蝉若虫死亡率增高,且电光叶蝉的寿命明显缩短。这些迹象表明RGDV侵染细胞后可能引起了细胞凋亡。为此,本研究对RGDV在介体昆虫内诱发细胞凋亡的机理进行了分析。通过TUNEL和流式细胞仪检测技术确定了 RGDV在介体培养细胞内能够引起细胞凋亡现象。并且细胞凋亡是依赖于Caspase通路调控的。荧光定量PCR(Real time PCR,RT-qPCR)结果表明Caspase家族基因和凋亡抑制基因IAP1在病毒侵染循环中表达上调,并且上调表达量与病毒积累量成正比关系。说明细胞凋亡相关因子对病毒的复制起着动态调控的作用。为了明确细胞凋亡发生对病毒增殖的影响,分别在培养细胞和介体昆虫干扰Caspase家族和IAP1基因的表达,研究病毒的增殖变化。结果显示干扰Caspase家族基因的表达明显抑制病毒在培养细胞的积累和介体昆虫的扩散,而抑制IAP1基因的表达促进病毒的积累和扩散。表明RGDV引发的细胞凋亡有助于病毒在介体昆虫内进行增殖。综上所述,本研究首次阐明了 RGDV在介体电光叶蝉的侵染循回过程;明确了病毒编码的非结构蛋白Pns7、Pns9和Pns12是形成病毒原质的组分,三个蛋白均参与病毒在介体内的复制,缺一不可;确定了病毒编码的非结构蛋白Pns11形成管状结构,参与病毒在介体培养细胞内的扩散。同时发现Gelsolin和Pns11的互作可能抑制病毒在细胞间的扩散,Gelsolin负调控病毒在介体培养细胞内的积累;此外,初步探讨了 RGDV侵染介体培养细胞和介体昆虫后引发细胞凋亡的机制,明确了细胞凋亡的发生有利于病毒在细胞内的增殖,为研究病毒和介体之间的互作关系奠定了基础。