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随着人们生活方式的改变,糖尿病的发病率不断攀升。糖尿病人血清胰岛素的变化是确诊、分类糖尿病类型的必须检查项目。快速、便捷、可靠的检查方法无疑是糖尿病病因确诊的必要手段。传统的酶联免疫分析法包括两次分子杂交,在临床检测等实际应用过程中耗时较长,增加了操作人员的劳动强度。通过基因工程构建一抗（单克隆抗体）和标记酶辣根过氧化物酶的重组融合蛋白sc Fv-HRP,将两次分子杂交（一抗结合胰岛素与二抗结合一抗）简化为一次分子杂交（胰岛素结合重组融合蛋白）,即可大大缩短酶联免疫分析的时长,降低工作人员的劳动强度,提高检测效率。本论文的主要研究结果如下:（1）以本实验室保存的转基因酵母菌P.pastoris GS115 sc Fv-HRP 1为材料,提取其核DNA,以引物SHP1和引物SHP2扩增sc Fv-HRP编码片段的1210至1780bp（总长度570bp）区域,以确定该菌株是否阳性。结果表明,P.pastoris GS115 sc Fv-HRP 1可扩增出一条清晰、专一、略大于500bp的条带。（2）于30℃、220rpm条件下培养P.pastoris GS115 sc Fv-HRP 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12号菌株48h,提取发酵液和细胞沉淀的蛋白质进行SDS-PAGE电泳分析。电泳结果表明:1至12号菌株均在63k Da（sc Fv-HRP的理论分子量）附近有特异性条带。该条带蛋白占细胞内总蛋白的含量分别为15.6%、16.6%、15.1%、1.9%、15.1%、11.5%、1.2%、0.8%、14.1%、16.0%、16.6%和8.4%（按1至12号菌株顺序）;该条带蛋白占发酵液总蛋白的含量分别为55.0%、51.9%、47.3%、0%、5.7%、82.2%、0%、0%、23.7%、62.2%、59.4%和11.1%（按1至12号菌株顺序）。（3）超声破碎收集P.pastoris GS115 sc Fv-HRP 1细胞,离心后的上清以50%的饱和硫酸铵进行沉淀。分级沉淀后的制备液上Ni-NTA亲和柱进一步纯化。结果显示:63k Da附近蛋白条带在洗涤缓冲液高达33.9%,而在洗脱缓冲液中基本不存在。这一结果暗示重组融合蛋白sc Fv-HRP可能不与Ni-HTA结合。（4）鉴于（3）的结果,我们对p GAP-sc Fv-HRP载体序列进行了重新核对,发现sc Fv-HRP编码片段末端存在移码突变,在Myc与His标签之前出现了一个终止密码子TAG,以致重组融合蛋白sc Fv-HRP未含有6×His标签。对其它菌株的纯化结果均与1号菌株类似,推测该终止密码子在构建转基因酵母菌之前即已出现。（5）鉴于（3）和（4）的结果,我们采用了阴离子交换树脂DEAE（DE-52）纯化重组融合蛋白sc Fv-HRP。P.pastoris GS115 sc Fv-HRP 1号菌株破碎后的离心上清液上层析柱,以p I5.3的洗脱缓冲液洗柱,分管收集洗脱液并测定280nm处吸光值,最大吸收峰值出现在6号管中。对3-9号管收集的样品进行SDS-PAGE分析,显示除了63k Da蛋白带外,仍有其它蛋白带存在。（6）分别以ABTS和愈创木酚为底物测定P.pastoris GS115 sc Fv-HRP的1-12号菌株破碎后上清中的辣根过氧化物酶活性。以ABTS为底物的测定结果显示,1-12号样品中的酶活性分别为1.77 U/m L、3.25 U/m L、4.15 U/m L、14.57 U/m L、13.15 U/m L、10.80U/m L、10.26 U/m L、6.79 U/m L、11.13 U/m L、6.98 U/m L、10.06 U/m L、8.94 U/m L,对照为0.02 U/m L。以愈创木酚为底物的测定结果显示,1-12号样品的酶活性分别为5.41U/m L、10.98 U/m L、6.59 U/m L、9.09 U/m L、7.13 U/m L、11.92 U/m L、5.10 U/m L、6.82U/m L、7.37 U/m L、2.98 U/m L、5.96 U/m L、3.84 U/m L,对照为0.01 U/m L。（7）对E.coli BL21 p ET-Ins菌株在30℃、220rpm条件下培养至OD600=0.6,再于26℃、220rpm条件下用1 mmol/L IPTG诱导表达4h。经SDS-PAGE分析表明:在破碎后的离心上清中,没有明显的重组人胰岛素原蛋白积累。在破碎后的离心沉淀中,重组人胰岛素原蛋白占总沉淀蛋白的55.3%。即人胰岛素原蛋白主要以包涵体形式存在。（8）对人胰岛素原蛋白包涵体分别使用尿素与包涵体洗涤液进行提取与溶解。经SDS-PAGE分析表明:用尿素提取并溶解包涵体的人胰岛素原蛋白纯度为86.5%,用包涵体洗涤液提取并溶解包涵体后人胰岛素原蛋白纯度为71.3%。（9）以上述人胰岛素原蛋白点硝酸纤维素膜（NC膜）,P.pastoris GS115 sc Fv-HRP11菌株表达的重组融合蛋白sc Fv-HRP进行斑点杂交,结果有阳性斑点出现（阴性对照未出现曝光斑点）。说明重组融合蛋白sc Fv-HRP具有专一性结合人胰岛素原及辣根过氧化物酶活性。