抑制H3K27me3去甲基化酶对哮喘气道重塑的影响

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【目的】迄今为止,众多的研究发现气道平滑肌细胞(airway smooth muscle cells,ASMCs)表型转换在支气管哮喘(简称哮喘)发病机制中发挥重要作用。而表观遗传学转录后修饰,尤其是甲基化修饰,作为哮喘发病中的重要机制,亦得到了广泛关注。其中,组蛋白H3第27位赖氨酸(H3K27)位点去甲基化在许多不同类型细胞的分化和增殖中发挥作用,但其在哮喘气道平滑肌细胞表型转换中的作用尚未研究过。因此,本研究旨在阐明H3K27去甲基化过程在哮喘中发挥的作用并探讨其相关机制。【方法】将40只SPF级BALB/c小鼠随机分为5组。通过每周连续5天,连续5周滴鼻屋尘螨(house dust mite,HDM)建立HDM诱导的慢性哮喘小鼠模型,其中三组在最后两周滴鼻前1 h分别腹腔注射GSK-J4、地塞米松(DEX)及二甲基亚砜(DMSO)。使用FinePointe RC小鼠肺功能仪直接测量肺阻力来评估小鼠肺功能,随后及时取支气管肺泡灌洗液(BALF),将其离心进行总细胞及分类细胞计数;酶联免疫吸附测定法(ELISA)分别检测各组小鼠BALF和血清中的总免疫球蛋白E(IgE)及BALF和肺组织匀浆中相关Th2类细胞因子、趋化因子水平;苏木精-伊红(H&E)染色评估气道炎症情况;过碘酸-雪夫(PAS)染色检测杯状细胞增生粘液分泌水平;Masson染色评估纤胶原沉积纤维化水平;免疫组织化学法(IHC)检测肌球蛋白轻链激酶(MLCK)及α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达水平。CCK-8法检测GSK-J4对ASMCs毒性作用,同时运用CCK-8、EdU及细胞周期法研究GSK-J4在PDGF诱导的细胞增殖模型中的作用。ELISA、迁移实验及划痕实验分别检测ASMCs合成和迁移能力。免疫荧光及western blotting法观察α-SMA和MLCK表达,相关信号通路的磷酸化水平亦采用western blotting法检测。【结果】与对照组小鼠相比,HDM造模组小鼠肺部三甲基化H3K27(H3K27me3)的表达水平明显减少。而使用H3K27me3去甲基化酶抑制剂(GSK-J4)可显著改善哮喘病理表现,如气道高反应性,气道炎症浸润,杯状细胞增生和胶原沉积纤维化等。离体实验中,我们建立ASMCs增殖/收缩模型来进一步探讨抑制H3K27me3去甲基化酶在ASMCs表型转换调控中的作用。GSK-J4可显著抑制PDGF引起的ASMCs增殖及迁移,相关机制可能为影响Akt/MAPKs信号通路活化;而GSK-J4对PDGF引起的VEGF合成无明显影响,且PDGF刺激未引起Eotaxin-1水平显著改变。同时,GSK-J4可通过调控Smad3通路磷酸化对TGF-β引起的ASMCs收缩起抑制作用。【结论】本研究提示了H3K27me3去甲基化在哮喘ASMCs表型转换中的重要作用。抑制H3K27me3去甲基化可抑制ASMCs增殖、迁移及收缩,其机制与调控Akt/JNK及Smad3信号通路磷酸化有关。
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