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本文主要从以下几方面展开论述：
第一部分 CYP3A4基因多态性对沙格列汀代谢的影响
目的：细胞色素P4503A4(CYP3A4)是人类重要的代谢酶，可代谢约30％至40％的治疗药物。这也说明CYP3A4的基因多态性可能会影响人体内经CYP3A4代谢的药物的代谢程度和消除速率。CYP3A4引起的多种个体差异可能导致治疗失败，发生不可预测的副作用或严重的药物毒性。沙格列汀是一种二肽基肽酶-4(DPP-4)抑制剂，被广泛用作抗糖尿病药。其在临床上使用时具有剂量低和体重增加风险低的优点。但是，沙格列汀也存在许多副作用，例如皮疹，荨麻疹和皮肤脱皮等。另外，肾衰竭，口腔溃疡和口腔炎风险还在评估中。本研究的目的是评估27个CYP3A4变异体在体外对沙格列汀代谢的催化活性，以及马西替坦和西地那非对沙格列汀在大鼠体内药代动力学的影响，从而为临床上使用沙格列汀提供更多的合理化建议。
方法：(1)用0.125％甲酸+10mM甲酸铵水溶液和乙腈作为流动相，建立定量测定5-羟基沙格列汀的高效液相串联质谱法(UPLC-MS/MS)，并选定低、中及高浓度对该UPLC-MS/MS方法进行精密度、准确度和稳定性等检验。
(2)通过筛选CYP3A4重组微粒体酶浓度、孵育时间以及孵育体系所用的缓冲液确定了孵育体系后，将CYP3A4.1和高表达的26种CYP3A4突变型的重组微粒体酶分别与25-4000μM浓度梯度范围内的底物沙格列汀在37℃水浴中孵育。40min后立刻置于-80℃冰箱终止反应。样品经乙腈沉淀法处理后用建好的UPLC-MS/MS方法定量检测代谢产物5-羟基沙格列汀。用Graphpad Prism5.0处理可得到CYP3A4.1(野生型)和26种突变型的酶动力学参数(Km、Vmax)。以CYP3A4.1为对照，运用SPSS统计软件经Dunnet检验方法，比较各个突变型代谢沙格列汀的酶活性大小，由此评估26个CYP3A4等位基因突变型对沙格列汀外代谢的活性大小。数据均用Mean±SD表示，*P＜0.05，表示有显著性差异。
结果：(1)成功建立了UPLC-MS/MS方法检测沙格列汀的代谢产物5-羟基沙格列汀的方法，该方法经验证表明具有高灵敏度和准确度、便捷快速且稳定的特点。(2)以清除率(Vmax/Km)作为评价CYP3A4各突变型对沙格列汀体外代谢活性的标准。与野生型CYP3A4.1相比，除CYP3A4.33外，其余25个等位基因均显示清除率降低(1.91-77.08％)。其中，5个典型的缺陷变异体(CYP3A4.11，CYP3A4.12，CYP3A4.17，CYP3A4.20，CYP3A4.23)的清除率值(1.91-7.90％)比典型的等位基因CYP3A4.2低，为清除率显著降低型。与野生型相比，CYP3A4.2的清除率降低约10.42％。13种变体(CYP3A4.3，CYP3A4.4，CYP3A4.7，CYP3A4.8，CYP3A4.9，CYP3A4.13，CYP3A4.16，CYP3A4.18，CYP3A4.24，CYP3A4.29，CYP3A4.31，CYP3A4.32，CYP3A4.34)的清除率高于CYP3A4.2，但低于CYP3A4.15(60.38％)。这些变异型为中等降低型(相对清除率为12.69-55.05％)。其余5个等位基因(CYP3A4.5，CYP3A4.10，CYP3A4.14，CYP3A4.19，CYP3A4.28)具有比CYP3A4.15高的清除率(62.12％-77.08％)，视为轻度降低型。
结论：我们的数据表明，大多数变异体对沙格列汀的催化活性显著降低。与内在清除率较高的型相比，具有清除率显著降低型和中度降低型的人群建议使用较低剂量的沙格列汀。
第二部分 药酶抑制剂西地那非对沙格列汀体内外代谢的影响
目的：研究西地那非和沙格列汀是否存在药物相互作用。
方法：(1)构建UPLC-MS/MS方法：采用Waters CORTECS UPLC HILIC柱(2.1mm*100mm,1.7μm)对样品进行分离，以0.125％甲酸+10mM甲酸酸铵水溶液和乙腈为流动相进行梯度洗脱。多反应监测模式和阳离子模式下，沙格列汀：316.3→180.2、内标阿格列汀：340.4→116.1对沙格列汀浓度进行检测。
(2)体外代谢的影响：在鼠肝、人肝和CYP3A4.1微粒体的孵育体系中，以沙格列汀为底物，西地那非为抑制剂进行评估。200μL的孵育体系在37℃恒温震荡仪中孵育40分钟，-80℃停止反应。用300μL乙腈和20μL2.5μg/mL阿格列汀处理样品。经2分钟涡旋和10分钟离心后所得上清稀释后，通过上述建立好的UPLC-MS/MS方法检测，得到相应的代谢产物5-羟基沙格列汀(5-hydroxy saxagliptin，5-OHSAX)的浓度，用Graphpad Prism5.0处理得到西地那非分别在鼠肝、人肝和CYP3A4.1中抑制沙格列汀代谢的IC50值。
(3)体内代谢研究：将12只雄性SD大鼠随机分为2组(n=6)：A组对照组：0.5mg/kg沙格列汀，B组实验组：8mg/kg西地那非和0.5mg/kg沙格列汀。B组给予西地那非后半小时给予沙格列汀，于5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、10小时和24小时尾端取血。血样离心后所得血浆，用300μL乙腈和2.5μg/mL阿格列汀处理。同样通过UPLC-MS/MS分析处理的样品中沙格列汀的活性代谢产物5-OHSAX浓度。应用DAS3.0软件进行药动学分析。
结果：(1)体外实验中，西地那非对沙格列汀在鼠肝、人肝和CYP3A4.1中的代谢，存在显著的抑制作用，IC50分别为22.49μM、28.68μM和31.49μM。当西地那非浓度为100μM时，西地那非抑制了约78.43％、70.76％和67.80％的沙格列汀在鼠肝、人肝和CYP3A4.1中的代谢。
(2)体内实验中，在西地那非的影响下，沙格列汀的药代动力学参数有明显的统计学差异。给予西地那非后，沙格列汀的AUC(0-t)增加为对照组的1.78倍、AUC(0-∞)增加为对照组的2.59倍，清除率CLz/F降低了约56.60％，Cmax增加为对照组的2.13倍。西地那非对沙格列汀在大鼠体内的具有明显的抑制作用。
结论：西地那非在体内体外对沙格列汀的代谢均有明显的抑制作用，因此临床用药中，需要密切关注两者的合用，必要时进行血药浓度监测。
第一部分 CYP3A4基因多态性对沙格列汀代谢的影响
目的：细胞色素P4503A4(CYP3A4)是人类重要的代谢酶，可代谢约30％至40％的治疗药物。这也说明CYP3A4的基因多态性可能会影响人体内经CYP3A4代谢的药物的代谢程度和消除速率。CYP3A4引起的多种个体差异可能导致治疗失败，发生不可预测的副作用或严重的药物毒性。沙格列汀是一种二肽基肽酶-4(DPP-4)抑制剂，被广泛用作抗糖尿病药。其在临床上使用时具有剂量低和体重增加风险低的优点。但是，沙格列汀也存在许多副作用，例如皮疹，荨麻疹和皮肤脱皮等。另外，肾衰竭，口腔溃疡和口腔炎风险还在评估中。本研究的目的是评估27个CYP3A4变异体在体外对沙格列汀代谢的催化活性，以及马西替坦和西地那非对沙格列汀在大鼠体内药代动力学的影响，从而为临床上使用沙格列汀提供更多的合理化建议。
方法：(1)用0.125％甲酸+10mM甲酸铵水溶液和乙腈作为流动相，建立定量测定5-羟基沙格列汀的高效液相串联质谱法(UPLC-MS/MS)，并选定低、中及高浓度对该UPLC-MS/MS方法进行精密度、准确度和稳定性等检验。
(2)通过筛选CYP3A4重组微粒体酶浓度、孵育时间以及孵育体系所用的缓冲液确定了孵育体系后，将CYP3A4.1和高表达的26种CYP3A4突变型的重组微粒体酶分别与25-4000μM浓度梯度范围内的底物沙格列汀在37℃水浴中孵育。40min后立刻置于-80℃冰箱终止反应。样品经乙腈沉淀法处理后用建好的UPLC-MS/MS方法定量检测代谢产物5-羟基沙格列汀。用Graphpad Prism5.0处理可得到CYP3A4.1(野生型)和26种突变型的酶动力学参数(Km、Vmax)。以CYP3A4.1为对照，运用SPSS统计软件经Dunnet检验方法，比较各个突变型代谢沙格列汀的酶活性大小，由此评估26个CYP3A4等位基因突变型对沙格列汀外代谢的活性大小。数据均用Mean±SD表示，*P＜0.05，表示有显著性差异。
结果：(1)成功建立了UPLC-MS/MS方法检测沙格列汀的代谢产物5-羟基沙格列汀的方法，该方法经验证表明具有高灵敏度和准确度、便捷快速且稳定的特点。(2)以清除率(Vmax/Km)作为评价CYP3A4各突变型对沙格列汀体外代谢活性的标准。与野生型CYP3A4.1相比，除CYP3A4.33外，其余25个等位基因均显示清除率降低(1.91-77.08％)。其中，5个典型的缺陷变异体(CYP3A4.11，CYP3A4.12，CYP3A4.17，CYP3A4.20，CYP3A4.23)的清除率值(1.91-7.90％)比典型的等位基因CYP3A4.2低，为清除率显著降低型。与野生型相比，CYP3A4.2的清除率降低约10.42％。13种变体(CYP3A4.3，CYP3A4.4，CYP3A4.7，CYP3A4.8，CYP3A4.9，CYP3A4.13，CYP3A4.16，CYP3A4.18，CYP3A4.24，CYP3A4.29，CYP3A4.31，CYP3A4.32，CYP3A4.34)的清除率高于CYP3A4.2，但低于CYP3A4.15(60.38％)。这些变异型为中等降低型(相对清除率为12.69-55.05％)。其余5个等位基因(CYP3A4.5，CYP3A4.10，CYP3A4.14，CYP3A4.19，CYP3A4.28)具有比CYP3A4.15高的清除率(62.12％-77.08％)，视为轻度降低型。
结论：我们的数据表明，大多数变异体对沙格列汀的催化活性显著降低。与内在清除率较高的型相比，具有清除率显著降低型和中度降低型的人群建议使用较低剂量的沙格列汀。
第二部分 药酶抑制剂西地那非对沙格列汀体内外代谢的影响
目的：研究西地那非和沙格列汀是否存在药物相互作用。
方法：(1)构建UPLC-MS/MS方法：采用Waters CORTECS UPLC HILIC柱(2.1mm*100mm,1.7μm)对样品进行分离，以0.125％甲酸+10mM甲酸酸铵水溶液和乙腈为流动相进行梯度洗脱。多反应监测模式和阳离子模式下，沙格列汀：316.3→180.2、内标阿格列汀：340.4→116.1对沙格列汀浓度进行检测。
(2)体外代谢的影响：在鼠肝、人肝和CYP3A4.1微粒体的孵育体系中，以沙格列汀为底物，西地那非为抑制剂进行评估。200μL的孵育体系在37℃恒温震荡仪中孵育40分钟，-80℃停止反应。用300μL乙腈和20μL2.5μg/mL阿格列汀处理样品。经2分钟涡旋和10分钟离心后所得上清稀释后，通过上述建立好的UPLC-MS/MS方法检测，得到相应的代谢产物5-羟基沙格列汀(5-hydroxy saxagliptin，5-OHSAX)的浓度，用Graphpad Prism5.0处理得到西地那非分别在鼠肝、人肝和CYP3A4.1中抑制沙格列汀代谢的IC50值。
(3)体内代谢研究：将12只雄性SD大鼠随机分为2组(n=6)：A组对照组：0.5mg/kg沙格列汀，B组实验组：8mg/kg西地那非和0.5mg/kg沙格列汀。B组给予西地那非后半小时给予沙格列汀，于5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、10小时和24小时尾端取血。血样离心后所得血浆，用300μL乙腈和2.5μg/mL阿格列汀处理。同样通过UPLC-MS/MS分析处理的样品中沙格列汀的活性代谢产物5-OHSAX浓度。应用DAS3.0软件进行药动学分析。
结果：(1)体外实验中，西地那非对沙格列汀在鼠肝、人肝和CYP3A4.1中的代谢，存在显著的抑制作用，IC50分别为22.49μM、28.68μM和31.49μM。当西地那非浓度为100μM时，西地那非抑制了约78.43％、70.76％和67.80％的沙格列汀在鼠肝、人肝和CYP3A4.1中的代谢。
(2)体内实验中，在西地那非的影响下，沙格列汀的药代动力学参数有明显的统计学差异。给予西地那非后，沙格列汀的AUC(0-t)增加为对照组的1.78倍、AUC(0-∞)增加为对照组的2.59倍，清除率CLz/F降低了约56.60％，Cmax增加为对照组的2.13倍。西地那非对沙格列汀在大鼠体内的具有明显的抑制作用。
结论：西地那非在体内体外对沙格列汀的代谢均有明显的抑制作用，因此临床用药中，需要密切关注两者的合用，必要时进行血药浓度监测。