牛源乳酸菌的筛选及其益生潜力评价

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乳酸菌是一种常见的益生菌,筛选和开发具有益生作用的乳酸菌能够减少抗生素的使用,对畜牧业的可持续发展具有重要意义。本研究旨在从健康犊牛粪便中筛选出具有潜在益生功能的新型乳酸菌菌株,并进一步在小鼠炎症模型中评价其益生效果,为益生性乳酸菌的开发和应用提供理论基础。经过划线、挑菌、革兰氏染色鉴定和16SrDNA测序分析,共获得一株新型乳酸菌,命名为Lactobacillus reuteri RGW1(L.RGW1),并送至中国菌种保藏中心保藏,菌种保藏号为CGMCC No.18626。通过体外试验,分析L.RGW1对病原菌的抑制能力,发现L.RGW1能够有效抑制大肠杆菌K99(Escherichia coli K99)和都柏林属沙门氏菌(Salmonella dublin)的生长,且其对S.dublin的抑菌作用显著大于现广泛应用的益生乳酸菌Lactobacillus paralimentarius;增加L.RGW1培养液的pH至7.0导致其丧失对E.coli K99和S.dublin的抑制能力,而热处理和蛋白酶K处理均不影响其抑菌性能。抗生素敏感性分析显示,L.RGW1对氨苄西林、阿莫西林、氯霉素、头孢唑林、红霉素、四环素和青霉素均具有敏感性,且对红霉素的敏感性显著大于L.paralimentarius,而对其他抗生素的敏感性小于L.parallimentarius。L.RGW1 不含有毒力基因 Gelatinase、Protein for activation of cytolysin、Enterococcal surface protein、Cell wall adhesins、Hyaluronidase、Aggregation substance、Histidine decarboxylase、Adhesion of collagen、Tyrosine decarboxylase和Ornithine decarboxylase;能够在pH低至3的酸性环境中生长,且在pH等于4的环境中,其存活数量显著大于L.paralimentarius(P=0.007);耐受胆盐,在含0.1%胆盐的环境中其存活数显著大于L.paralimentarius(P<0.01),而在含0.5%胆盐的环境中其存活数显著小于L.paralimentarius(P=0.006);能够耐受模拟胃液和肠液,对模拟胃液耐受能力显著低于L.paralimentarius P<0.01),而对模拟肠液的耐受能力显著高于L.paralimentarius(P<0.01)。同时,L.RGW1的疏水性显著高于I.paralimentarius(P=0.001),并对Caco-2肠道上皮细胞具有良好的粘附能力。因此,体外试验结果显示,L.RGW1具有抑制E.coli K99和S.dublin的能力,对常用的抗生素敏感,不含有毒力基因,能抵抗胃肠道内环境,且对肠上皮细胞有较强的粘附能力,具有作为益生菌在体内使用的潜力。进一步在小鼠模型中探究L.RGW1在体内的益生作用。试验采用36只5周龄C57/BL雌性小鼠,随机分为四组,通过对小鼠口腔灌胃无菌PBS(对照组)、去除L.RGW1菌细胞的培养液(上清组)、辐照灭活L.RGW1菌液(辐照组)和L.RGW1活菌菌液(活菌组)7天后,对小鼠腹腔注射LPS以诱导急性炎症,分析试验期内小鼠采食量和体重的变化,试验结束后屠宰小鼠,分析各组小鼠血清炎症因子浓度和肠道组织形态的差异。试验结果显示,和对照组相比,辐照组小鼠体重在第2天和第4天显著降低,上清组和活菌组小鼠体重无显著变化;各组小鼠采食量均没有显著变化,仅在第1天时,辐照组小鼠采食量显著低于对照组;上清组血清TNF-α浓度显著低于对照组,而活菌组血清IL10和TGF-β的浓度显著高于对照组;和对照组相比,上清组、辐照组和活菌组小鼠结肠和盲肠组织淋巴细胞增生减少,活菌组结肠绒毛高度和绒毛/隐窝比值显著增加(P=0.022),上清组结肠隐窝深度显著降低。因此,给小鼠灌胃L.RGW1能够抑制LPS诱导的急性炎症反应,并促进结肠绒毛的生长。综上所述,本试验从健康犊牛粪便中成功获得一株新型乳酸菌L.RGW1,经体外益生潜力分析和体内益生效果的初步评估,该乳酸菌具有作为益生菌使用的潜力。后续试验应进一步探究L.RGW1在体内作用的机制,挖掘其发挥益生作用的生物活性物质,为其后续的商品化开发和在养殖行业的广泛应用提供理论基础。
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