单功能烷化剂N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine，MNNG)是一种在环境中广泛存在的化学诱变剂和致癌剂，它能和DNA及蛋白质等生物大分子形成加合物(adduct)。碱基的甲基化损伤，最重要的是O~6-甲基鸟嘌呤导致基因突变形成，后者即发生在损伤碱基的部位。但是环境诱变剂引起的突变也可发生在非DNA损伤部位，它被称之为非定标性突变(nontargeted mutagenesis)。这种突变除了可能由DNA损伤触发的途径外，已证明还有非核起源的信号触发的外遗传(epigenetic)途径介入，激活细胞信号转导通路，引起一系列基因表达的改变而最终导致突变的形成。 我们实验室的研究证明低剂量MNNG处理后的哺乳动物细胞中也存在非定标突变，并且哺乳动物细胞非定标突变的发生机制依赖于细胞信号转导通路介导的基因表达改变。我们发现，低剂量MNNG处理后的人羊膜FL细胞有广泛的细胞反应，并有多个信号转导通路的激活和基因表达的改变。例如DNA复制保真度下降，DNA聚合酶谱发生改变，应用报告基因技术和底物磷酸化检出技术证明细胞一系列转录因子如AP1、CREB、NFκB等被激活，细胞表面受体如表皮生长因子受体、肿瘤坏死因子受体发生聚簇，细胞信号转导通路cAMP-PKA-CREB和JNK／SAPK被激活。更值得注意的是这些有关信号转导通路的激活有的并不依赖于细胞核中的DNA损伤，因为在除去细胞核的细胞中有些细胞通路的激活仍可被诱发。应用蛋白质组学技术发现受低剂量MNNG攻击的FL细胞中蛋白质谱发生了广泛的变化，有60多个蛋白斑点在MNNG处理后发生了显著的变化。鉴定出的蛋白包括多个与转录调控相关的锌指蛋白，如锌指蛋白198、263、14、224、zf6、转录抑制因子cTcF样蛋白、幻肚pple样锌指蛋白等:两个含金属蛋白酶结构域和整合素结合结构域的家族成员ADAM28和ADAM17;两个整合素家族成员pZ整合素和含十个EGF样结构域的整合素(TIED);与细胞信号转导通路有关的蛋白;与细胞周期调控有关的蛋白;与染色体重塑和基因转录抑制有关的蛋白;细胞骨架蛋白以及其他功能未明的蛋白等。 蛋白质表达可以在多个水平受到调控，但是最重要的调控发生于转录起始阶段。本研究对我们实验室前述的蛋白质组学研究结果进行了进一步分析，对表达上调的八个蛋白质的编码基因启动子区进行转录因子结合部位预测，以了解这些蛋白质之间是否存在共同的转录调控通路。我们首先获得这些蛋白质的编码基因，再通过基因组间比较得到它们在小鼠中的同源基因及其启动子。为降低假阳性率，提高预测可靠性，采用进化足迹方法(phylogenetic footPriniing)，获取同源基因启动子的保守区，搜索TRANsFAC转录因子结合部位(transeription faetor bindingsites)位置权重矩阵(position weight matriees，pwM)数据库，筛选出在这些基因启动子保守区中共同存在的转录因子结合部位。并用凝胶阻滞试验进行验证，确定有关转录因子是否在MNNG处理的细胞中发生反应。 在人和小鼠间建立同源基因关系 通过质谱鉴定得到的8个MNNG诱导表达的蛋白质，其编码基因一ZNF 198、ITGBLI、ADAM17、KNG、ITGBZ、PRKCBPI、Fg、ADAM28一的mRNA从GenBank数据库中获取。为减少冗余，仅选取Re份eq的mRNA参考序列来建立人与小鼠的同源基因对。每个mRNA用BLASTN程序与GenBank数据库中的小鼠核酸序列进行比对，找出与其匹配程度最高的mRNA序列，将该序列重新用BLASTN程序与数据库中人的核酸序列比对，如果其中匹配程度最高的序列与最初输入的人mRNA序列一致，则将小鼠中这条序列的编码基因作为人类该基因的同源基因。 转录物定位并建立同源启动子对 为保证进行转录物定位的mRNA其夕端尽量接近转录起始点，每个基因相关的mRNA都用Clustalw进行比较，确定夕端最完整的mRNA，并用MegaBLAST将cDNA与基因组序列比对，确定其5’端位置(见p43，附录2)。选取第一外显少子上游5000bP的序列为包含启动子的转录调控区。人基因的启动子位置进一步用启动子预测软件Fir此F、promoterlnspeetor等进行初步验证(见pl7，表6). 启动子中转录因子结合部位的比较分析 用DBA程序，默认设置，获取每一对同源启动子对的保守区域(见P47，附录3)。分别选取各个基因5’端上游l000bP，用MATCH程序搜索TRANSFAC的PwM中脊椎动物转录因子结合部位数据库，参数矩阵相似性(matrix sirnilarity)的域值定为0.8。矩阵相似性参数的范围是0.0一1.0，0.8的相似性已经非常高。将MATCH的输出结果保存于Excel表格中(见p54，附录4)。再将每对基因所得的结果进行比较，选取位于保守区内，人和小鼠都含有的转录因子结合部位，作为该基因转录因子结合部位的最终输出结果。对这些共表达蛋白启动子区的转录因子结合部位进行横向比较，找到它们共有的转录因子结合部位。 这8个基因在小鼠基因组中都找到了其对应的同源基因(见P15，表3一表4)。由于人和小鼠的ITGBZ基因启动子间用DBA程序没有发现明显的保守区(p50，附录3)，在下一步转录因子结合部位的比较分析时舍