细菌生物膜(biofilm)是细菌黏附于非生物或生物表面后将其包裹在自身分泌的多聚物中形成的一种具有立体结构的细胞群落,组成细菌生物膜的胞外多聚物中包括主要成分多糖和游离DNA、RNA、蛋白质、脂类和其他物质。大肠杆菌(Escherichia coli)是医院感染的重要病原菌之一,也是生物膜感染的常见病原菌。形成生物膜的大肠杆菌具有高度的耐药性并能逃避免疫系统的攻击,其感染易慢性化并难于控制。生物膜的耐药机制主要包括渗透障碍、生物膜内细菌对抗菌药物不敏感的特殊生理状态和部分耐药基因的高表达。细菌形成生物膜过程中,通过群体感应系统(Quorum Sensing,QS)调节,细菌裂解释放大量游离DNA,构成细菌生物膜的骨架,维持生物膜的空间构象。生物膜内高浓度的细菌细胞呈紧密接触状态,加之高浓度游离的DNA存在,为细菌生物膜内基因的传递提供了有利条件。既往以某一特定的耐药基因为目标,通过对不同时间段该基因在不同菌属间的分布,推断不同细菌属间可以发生基因组基因的传递,因发生机率较低,并无直接观察的证据进行说明。迄今对细菌生物膜内基因的传递多采用带有明显筛选特征的质粒进行传递现象的观察,已有报道的细菌包括真养产碱杆菌(Alcaligenes eutrophus)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、不动杆菌(Acinetobacter sp.)和变形链球菌(Streptococcus mutans)等,其中真养产碱杆菌、铜绿假单胞菌、乳酸乳球菌可以发生接合传递,不动杆菌和变形链球菌可以在自然条件下形成感受态而发生转化;即使自然条件下不能形成感受态的大肠杆菌,也在生物膜形成过程中观察到了质粒的传递。与浮游细胞相比,生物膜内质粒的传递具有高效的特点,最高可达上万倍。细菌生物膜内发生的这种基因传递可能也是细菌获得耐药基因的主要途径,并且随着生物膜的解离,获得耐药基因的菌株将导致细菌耐药性的播散,造成更大危害。同时这些研究表明,形成生物膜是基因发生细菌间传递的重要保证条件,因此可以影响生物膜形成的调控因素必将对生物膜内发生的基因传递具有调节作用。对其影响因素和机制的研究有助于提高对生物膜内耐药基因播散的认识,但目前罕有报道。本研究以大肠杆菌为对象,针对其生物膜形成的两个重要调节基因LuxS和pga操纵子开展研究,它们分别编码大肠杆菌群体感应系统信号分子合成酶和生物膜中多糖主要成分β-1-6-N-乙酰-葡聚糖胺合成酶,在细菌生物膜形成过程的初始黏附和生物膜成熟过程中均具重要的调节作用。本研究收集第三军医大学第一附属医院临床分离的野生型大肠杆菌,对其耐药性和形成生物膜的能力以及不同培养基对生物膜形成的影响因素进行分析;研究临床分离株和大肠杆菌标准菌形成的生物膜内耐药质粒的传递频率;通过荧光定量PCR分析含0.5%糖的LB培养基对生物膜主要调控基因luxS和pga的表达的影响;构建大肠杆菌CAG18439群体感应系统信号合成酶基因luxS敲除株,研究luxS敲除株生物膜内耐药质粒传递的变化,并探讨其机制。研究分四部分进行:1.临床分离大肠杆菌的耐药性和生物膜形成能力的研究;2.大肠杆菌CAG18439生物膜内耐药质粒传递的研究;3.含糖(0.5%)LB培养基对生物膜的形成和主要调控基因luxS和pga表达的影响;4. luxS基因敲除大肠杆菌株生物膜形成及其对耐药质粒传递的影响。材料和方法1.材料临床分离大肠杆菌共127株(S1、S2、S3……S127),均分离于第三军医大学第一附属医院2005年7月~2007年12月住院患者的临床送检标本;大肠杆菌ATCC25922、DH5α(PGreenTIR-)(F-,φ80d lacZ△M15,△(lacZYA-argF)U169, deoR, recA1, endA1, hsdR17(rk-,mk+ )和MG1655为重庆西南医院国家药品临床研究基地保存菌株;大肠杆菌CAG18439(F, lacZ118(Oc), lacI3042::Tn10, LAM- rph-1)由军事医学科学院徐琪寿教授馈赠;DH5α(PGreenTIR+),含原核绿色荧光表达非接合型质粒,由武汉大学病毒研究所李果博士馈赠。2.方法2.1临床分离大肠杆菌的耐药性和生物膜形成能力的研究2.1.1 127株临床分离大肠杆菌对10种常用药物的MIC测定头孢他定、氯霉素、卡那霉素、四环素、氨曲南、头孢哌酮、左氧沙星、氨苄西林、氨苄西林/克拉维酸和亚胺培南对临床分离大肠杆菌的敏感性实验,采用琼脂倍比稀释法;2.1.2 127株临床分离大肠杆菌中β-内酰胺酶耐药菌株携带常见β-内酰胺酶基因的PCR检测根据127株大肠杆菌的药敏结果,选择头孢他定和头孢哌酮耐药株以及在256μg/ml的浓度下氨苄西林/克拉维酸可以逆转氨苄西林耐药的菌株,根据以上标准,筛选耐药大肠杆菌,对TEM等7种β-内酰胺酶基因的检测,采用PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳验证,选择1个阳性产物测序;临床分离大肠杆菌β-内酰胺酶基因的同源性分析,采用扩增产物测序在Genebank序列比对。2.1.3 127株临床分离大肠杆菌形成生物膜的研究大肠杆菌在LB培养基中生物膜形成的检测,采用96孔板结晶紫染色法;大肠杆菌形成生物膜的能力和细菌耐药性的相关性分析,采用非配对t检验;2.2大肠杆菌CAG18439生物膜内耐药质粒传递的研究2.2.1大肠杆菌CAG18439摄取外源耐药质粒pGreenTIR的研究pGreenTIR质粒的提取采用碱裂解法;对检测生物膜中细菌摄取质粒的GFP标记法和96孔板抗性筛选法进行方法学探讨,确定观察方法;比较加入文献报道生物膜DNA含量的等量外源性质粒浓度时,大肠杆菌ATCC25922、MG1655、临床分离低耐药株S17(对氨苄青霉素敏感)、DH5α和CAG18439在接种后24h对质粒的摄取频率。研究大肠杆菌CAG18439株接种后不同时间点(4h、8h、12h、16h、24h、36h和48h)以及接种后24h不同外源性质粒浓度(0.5μg/ml、1μg/ml,2μg/ml、4μg/ml和8μg/ml)时对质粒的摄取频率的变化;并加入文献报道生物膜DNA含量的等量外源性质粒浓度,测定生物膜细菌和浮游菌接种后24h和48h时的质粒摄取频率。2.2.2不同培养基对大肠杆菌CAG18439与DH5α(PGreenTIR+)共生形成生物膜过程中细菌间质粒传递的研究2.2.2.1共生培养耐药质粒最佳观察时间的确定,以常规LB培养基(pH7.4)共生培养DH5α(PGreenTIR+)与CAG18439形成生物膜过程中耐药质粒的传递, 96孔板双抗性筛选法检测细菌接种后4h、8h、12h、16h、24h、36h和48h耐药质粒的传递频率。2.2.2.2不同培养基对大肠杆菌CAG18439与DH5α(PGreenTIR+)共生形成生物膜过程中细菌间质粒传递的影响。以常规LB培养基(pH7.4)为对照,按2.2.2.1确定时间,96孔板双抗性筛选法检测细菌接种于不同培养基:含0.5%糖或100mMCaCl2的常规LB和TSB培养基(pH7.4)、偏酸(pH6)和偏碱(pH9)LB培养基共生培养DH5α(PGreenTIR+)与CAG18439形成生物膜过程中测定质粒传递的频率;相同条件下测定大肠杆菌生长曲线。2.3含糖(0.5%)LB培养基对生物膜的形成和主要调控基因luxS和pga表达的影响2.3.1 127株临床分离大肠杆菌生物膜形成的主要调控基因luxS和pga的PCR检测大肠杆菌生物膜形成相关基因pga和luxS的检测,采用PCR方法扩增,琼脂糖凝胶电泳验证。2.3.2含糖(0.5%)LB培养基对大肠杆菌株生物膜的形成及其luxS和pga基因表达的影响127株临床分离株和4株实验室菌株(ATCC25922、DH5α、MG1655和CAG18439),含0.5%糖的LB培养基与LB培养基中细菌生物膜形成能力采用96孔板结晶紫染色法,采用配对t检验分析;分别选择生物膜形成增强和减弱最明显的菌株,采用荧光定量PCR方法检测pga和luxS的表达。2.4 luxS基因敲除大肠杆菌株生物膜形成及其对耐药质粒传递的影响2.4.1大肠杆菌CAG18439 luxS基因敲除株的构建pAT2-kan质粒的构建,PCR扩增kan基因全序列,产物加A尾后连入pAT2载体;pAT2-△luxS载体的构建,PCR分别扩增大肠杆菌CAG18439 luxS基因上游序列和下游序列,产物加A尾后连入pAT2载体,测序正确后,将pAT2-kan质粒和含上游序列pAT2质粒分别采用BamH I和Nde I双酶切,分别胶回收后,将上游序列连接入pAT2-kan质粒,同样方法将下游序列连接入已连接入上游序列的pAT2-kan质粒;同源重组片断的获得,将pAT2-kan质粒转化入DH5α感受态细胞,增菌后提取质粒,XhoI和BamH I双酶切后胶回收获得同源重组片断;CAG18439luxS基因敲除株的获得,采用电转化导入同源重组片段的方法;大肠杆菌CAG18439luxS基因敲除的鉴定,采用PCR扩增测序的方法。2.4.2 luxS基因敲除大肠杆菌株生物膜形成及其对耐药质粒传递的影响大肠杆菌CAG18439△luxS接种后24h,分别96孔板结晶紫染色法和抗性筛选法对生物膜形成能力及其耐药质粒传递频率进行测定,生物膜内游离DNA的定量采用乙醇沉淀法。CAG18439△luxS菌株接种后16h pgaC mRNA表达,采用RT-PCR方法。3.主要结果3.1临床分离大肠杆菌的耐药性和生物膜形成能力的研究MIC测定显示,127株临床分离大肠杆菌除对亚胺培南100%敏感外,对氯霉素、卡那霉素、四环素、氨曲南、头孢他定、头孢哌酮、左氧沙星、氨苄西林、氨苄西林/克拉维酸的耐药率分别为74.8%(95/127)、63.0%(80/127)、95.3(121/127)、48.8%(62/127)、59.8%(76/127)、40.9%(52/127)、37.8%(48/127)、74.0%(94/127)和49.6%(63/127)。57株β-内酰胺酶耐药株中,bla-PER、bla-TEM、bla-PSE、bla-OXA、bla-CTX、bla-SHV和bla-VEB扩增阳性的比例分别为0%(0/59)、85.96%(49/57)、66.67%(38/57)、14.04%(8/57)、82.46%(47/57)、22.81%(13/57)和19.30% (11/57);与PUBMED上对应基因进行同源性分析,进行测序的5种(bla-TEM、bla-OXA、bla-CTX、bla-SHV和bla-VEB)β-内酰胺酶扩增产物的同源性均大于98%。临床分离的大肠杆菌普遍可以形成生物膜,细菌形成生物膜的能力和细菌的耐药性没有相关性。3.2大肠杆菌CAG18439生物膜内耐药质粒传递的研究3.2.1大肠杆菌CAG18439摄取外源耐药质粒pGreenTIR的研究GFP标记法中偶然因素对质粒摄频率的结果影响大,所以确定以96孔板抗性筛选法进行实验;在质粒浓度为2μg/ml时,在接种后24h大肠杆菌菌株ATCC25922、MG1655、DH5α和CAG18439的摄取频率分别为0.67×10-8、0.33×10-8、1.40×10-7和1.71×10-7,而S17未见细菌生物膜内的质粒摄取;大肠杆菌CAG18439接种后4h、8h、12h、16h、24h、36h和48h,耐药质粒的摄取频率分别为0.22×10-7、0.36×10-7、0.68×10-7、1.22×10-7、1.57×10-7、2.03×10-7和1.93×10-7;在0.5μg/ml,1μg/ml,2μg/ml,4μg/ml和8μg/ml浓度的质粒时,接种后24h质粒的摄取频率分别为0.53×10-7、1.13×10-7、1.68×10-7、1.84×10-7和2.40×10-7;生物膜细菌与浮游菌在接种后24h和48h,质粒摄取频率分别为1.72×10-7和2.31×10-7,3.16×10-10和8.62×10-10。3.2.2常规LB培养基(pH7.4)共生培养DH5α(PGreenTIR+)与CAG18439形成生物膜在接种后4h、8h、12h、16h、24h、36h和48h耐药质粒的传递频率分别为0、1.78×10-8、6.89×0-8、1.13×10-7、2.07×10-7、2.37×10-7和3.10×10-7;含0.5%糖或100mM CaCl2的常规LB和TSB培养基(pH7.4)、偏酸(pH6)和偏碱(pH9)LB培养基共生培养DH5α(PGreenTIR+)与CAG18439形成生物膜在接种后24h质粒的传递频率分别为2.20×10-7、2.43×10-7、2.40×10-7、2.13×10-7、1.80×10-7和1.73×10-7,采用one way ANOVA统计学分析方法分析不同培养基与LB培养基(pH7.4)中质粒传递的差异,p>0.05,无显著差异;生长曲线测定结果显示不同培养基对细菌的生长无显著影响。3.3含糖(0.5%)LB培养基对生物膜的形成及其主要调控基因luxS和pga表达的影响3.3.1 127株细菌均含有pga和luxS基因。3.3.2含糖(0.5%)LB培养基对大肠杆菌生物膜的形成及其luxS和pga基因表达的影响配对t检验发现29(29/131)株生物膜形成能力显著增强,42(42/131)株显著减弱;生物膜形成能力增强最显著的菌株为S59,形成能力减弱最显著的菌株为S100。S59菌株pga和luxS的表达较常规LB培养细菌增高;S100菌株pga的表达降低,但luxS表达增高。3.4 luxS基因敲除大肠杆菌株生物膜形成及其对耐药质粒传递的影响3.4.1大肠杆菌CAG18439luxS基因敲除株的构建PCR扩增产物测序证明成功构建luxS基因敲除株。3.4.2 luxS基因敲除大肠杆菌株生物膜形成及其对耐药质粒传递的影响接种后24h的研究发现,大肠杆菌CAG18439△l uxS生物膜形成能力下降,生物膜内游离DNA含量减少,质粒的传递频率下降。接种后16h pgaC mRNA表达水平降低。4.全文结论4.1临床分离大肠杆菌的耐药率较高,并存在一株细菌携带多个β-内酰胺酶耐基因,一种β-内酰胺酶耐药基因分布于多个细菌的情况,在正常培养条件下几乎全部的菌株都可以形成生物膜,但其形成生物膜的能力有较大差异,菌株的耐药性与生物膜形成能力之间没有显著差异。4.2细菌生物膜内耐药质粒的传递存在菌株特异性,在生物膜初始形成时发生的频率最高,且这种转化频率随质粒浓度的增加而增高,但无线性关系;不同培养基和钙离子的存在对生物膜内耐药质粒的传递影响不明显,表明这种耐药质粒的传递机制是完全不同于常规的转化途径。4.3 127株大肠杆菌均存在pgaA、pgaB、pgaC、pgaD和luxS基因,提示pga和luxS基因具有较高的保守性;含0.5%的糖的LB培养基对不同菌株可以表现为对细菌生物膜形成能力的增强和减弱,细菌pga基因的表达与其作用相一致;但无论是在生物膜形成能力增强还是在生物膜形成能力减弱的菌株,luxS基因的表达均表现为上调,表明luxS作为生物膜形成的上游调控基因,对外界环境的变化反应灵敏,而pga只是生物膜调控的效应基因,其表达强弱与生物膜的形成强弱一致。在pga基因固有表达就低的菌株,即使环境因素导致luxS基因表达上调,生物膜的形成仍不会增强。4.4大肠杆菌CAG18439luxS基因缺失株生物膜形成能力下降,生物膜内耐药质粒的传递频率降低,其机制可能是luxS突变导致pga的表达下调,生物膜形成能力下降,同时细菌裂解释放游离的DNA减少所导致。