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目的:受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase,RTK)是一类存在于细胞膜表面,调控细胞生长和分化的受体蛋白。表皮生长因子受体(E受体)是RTK家族主要成员之一,当受到表皮生长因子等配体激活后,E受体通过自身酪氨酸残基的磷酸化激活下游多种信号通路,促进细胞生长、增殖?分化和转移。E受体信号通路的持续激活与多种癌症的发生发展密切相关。EPS同源蛋白(EPSH)是一类参与膜蛋白转运的蛋白,并具有ATP酶结构域,通过水解ATP发挥调控作用。本课题旨在探讨EPSH及其ATP酶活性在E受体内吞转运过程中的作用。方法:1、Western blot(WB)技术检测细胞系中相关蛋白的表达水平,筛选EPSH和E受体中度表达的细胞系作为本研究的模型细胞。2、免疫荧光(Immunofluorescence,IF)技术研究内?外源EPSH和E受体在细胞中的定位情况及其共定位关系。3、利用免疫荧光和活细胞成像技术分别对EGF刺激以及照射后的细胞检测内源和过表达EPSH对E受体的内吞调控作用。4、利用免疫荧光技术研究EGF以及照射下EPSH调控E受体内吞过程中可能参与的其它分子途径。5、利用免疫荧光技术研究EPSH沉默对E受体内吞的影响。6、利用免疫荧光技术、活细胞成像技术,通过建立各种EPSH的ATP酶突变体,包括失活性突变体(失活突变)和活化性突变体(组成性活化突变),在EGF刺激和照射条件下,分别研究对E受体内吞转运的作用。结果:1、HeLa细胞中EPSH与E受体均呈中度表达,可以作为本课题研究的模型细胞。2、免疫荧光结果显示,饥饿(无血清)培养时,EPSH与E受体均定位于胞膜,且两者存在有共定位,而在稳态培养(10%血清)时,过表达的EPSH膜浆均有表达,E受体膜表达,且有少量囊泡共定位。3、HeLa细胞中,免疫荧光和活细胞成像技术表明,EGF刺激或照射后,过表达EPSH或内源EPSH在处理后的不同时间点,均与E受体形成囊泡,调控E受体内吞转运。4、HeLa细胞中,WB结果显示,Caveolin-1(CAV1)和Clathrin(CLTC)均有一定水平的表达。免疫荧光显示,EGF刺激或照射后,过表达的EPSH和内源E受体的内吞转运囊泡与CAV1存在有明显的共定位,而与CLTC共定位不明显。5、HeLa细胞中,免疫荧光显示,EPSH沉默组相较于对照组,内源E受体内吞加快。6、HeLa细胞中,免疫荧光和活细胞成像技术表明,过表达EPSH的失活性突变体后,EGF刺激或照射后E受体仍会锚定在细胞膜上,极少有内吞;过表达EPSH的活化性突变体后,E受体会与EPSH有囊泡状共定位,且E受体极少定位于细胞膜。结论:1、He La细胞中,配体激活或照射下,EPSH均以囊泡运输的方式参与调控E受体的内吞转运。2、HeLa细胞中,配体激活或照射下,EPSH参与E受体的内吞转运调控途径均以Caveolae途径为主,而Clathrin途径不明显。3、EPSH可以维持E受体膜稳定性,EPSH沉默导致E受体内吞增强。4、EPSH的失活性突变体增强了EPSH维持E受体膜稳定性的能力,而活化性突变体降低EPSH维持E受体膜稳定性的能力,提示EPSH对于E受体的膜稳定性调控主要依赖于ATP酶结构域。