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我国食管癌发病率位居世界首位,开发新型药物、分子靶向治疗食管癌成为研究的热点。3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(3-phosphoinositide-dependent protein kinase 1, PDK1)属于AGC激酶家族,其介导调节的PI3K/Akt信号转导通路异常与多种恶性肿瘤的发生发展密切相关。PDK1是Akt、p70-S6K、RSK、PKC等AGC激酶活化环的主要上游激酶,作为Akt上游激酶,1997年被Alessi DR等分离鉴定,可以磷酸化Akt的Thr308位点使其激活,活化的Akt调节其下游的多条路径,继而影响糖类代谢、蛋白转录翻译、细胞增殖、迁移以及抗凋亡。PDK1可能成为当前肿瘤治疗研究中新的靶点。RNA干扰(RNA interference, RNAi)是一种转录后的基因沉默现象,具有高效、高特异性等优点,已经被广泛应用于基因功能鉴定、基因表达转录后调控等研究领域,同时也为多种疾病特别是恶性肿瘤的基因治疗开拓了新的思路。UCN-01(7-hydroxy staurosporine)是目前已有的文献报道中研究较成熟的PDK1抑制剂,是星孢菌素(staurosporine)的7α羟基衍生物。UCN-01能通过竞争性抑制PDK1的ATP结合位点而抑制其激酶活性,从而使下游Akt磷酸化水平下降,干扰下游信号转导进而影响细胞代谢、增殖和凋亡,引起细胞毒作用。本研究采用PDK1 siRNA及其抑制剂UCN-01沉默食管癌EC9706细胞中PDK1基因,阻断PI3K/Akt信号转导通路,观察下游Akt蛋白磷酸化水平的变化,及其对细胞增殖、凋亡的影响,为寻求食管癌的分子靶向治疗途径提供实验依据。材料和方法1.高分化人食管鳞癌EC9706细胞株于37℃、5%CO2孵育箱中培养,以RNAi-Mate转染试剂介导PDK1 siRNA转染细胞,或以50nM、100nM、200nM浓度的UCN-01分别作用于细胞24h、48h、72h。2.采用RT-PCR技术检测各组细胞中PDK1 mRNA的表达。3.采用Western Blot技术及免疫细胞化学法检测各组细胞中PDK1、Akt p-Akt的蛋白表达。4.采用MTT法检测各组细胞生长抑制率。5.采用TUNEL及流式细胞术检测各组细胞凋亡的变化情况。6.统计学处理：应用统计软件SPSS13.0分析实验数据,检验水准a=0.05。结果1. siRNA转染效率检验：不同浓度Negative control FAM-siRNA转染EC9706细胞,6h后在荧光显微镜下观察,浓度100nM组转染效率最高,后续siRNA转染实验均采用此浓度。2. PDK1 siRNA的筛选：与细胞对照组相比,Negative control siRNA组和RNAi-Mate组对PDK1 mRNA表达没有影响,且二者之间无明显差异(P>0.05)。三条PDK1 siRNA转染EC9706细胞的PDK1 mRNA水平均低于细胞对照组(P<0.05),其中PDK1 siRNA1抑制效率最高(P<0.05),筛选出PDK1 siRNAl序列进行后续试验。3. PDK1 siRNA、UCN-01对PDKl mRNA表达的影响：PDK1 siRNA1转染EC9706细胞可下调PDK1 mRNA表达,以转染72h较显著(P<0.05); UCN-01也能够下调EC9706细胞PDKl mRNA表达,且具有浓度依赖性和作用时间依赖性(P<0.05); PDK1 siRNA1下调细胞PDK1mRNA表达的能力强于浓度200nM的UCN-01(P<0.05)。4. PDK1 siRNA、UCN-01对PDK1蛋白表达及Akt磷酸化水平的影响：PDK1siRNA1可下调PDK1、p-Akt蛋白表达,以转染72h较显著(P<0.05); UCN-01也能够下调细胞PDK1、p-Akt蛋白表达,且具有浓度依赖性和作用时间依赖性(P<0.05); PDK1 siRNAl下调细胞PDK1、p-Akt蛋白表达的能力比浓度200nM的UCN-01强(P<0.05); PDK1 siRNA、UCN-01对于Akt蛋白表达的影响无统计学差异(P>0.05)。5. PDK1 siRNA、UCN-01对EC9706细胞增殖的影响：与各对照组相比,PDK1 siRNA、UCN-01可提高细胞生长抑制率,且具有时间依赖性(P<0.05)；UCN-01对生长抑制率的影响还具有浓度依赖性(P<0.05); PDK1 siRNA对细胞生长抑制率的影响强于浓度200nM的UCN-01(P<0.05)。6. PDK1 siRNA、UCN-01对EC9706细胞凋亡的影响：PDK1 siRNA、UCN-01作用于EC9706细胞72h后早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞比例增加(P<0.05)；UCN-01对EC9706细胞凋亡的影响具有浓度依赖性(P<0.05); PDK1 siRNA1促进EC9706细胞凋亡的能力比浓度200nM的UCN-01更强(P<0.05)。结论1. PDK1 siRNA能有效沉默EC9706细胞PDK1基因的表达,下调其下游Akt蛋白磷酸化水平,从而阻断PI3K/PDK1/Akt信号转导通路,抑制EC9706细胞增殖,诱导细胞凋亡,表明PDK1可能是食管癌分子治疗的有效靶点2.PDK1化学抑制剂UCN-01能够抑制EC9706细胞PDK1基因表达及Akt蛋白磷酸化,阻断PI3K/PDK1/Akt信号转导通路,抑制细胞增殖及诱导其凋亡,这可能是UCN-01发挥抗肿瘤作用的重要机制之一,UCN-01有望成为新型肿瘤靶向治疗药物。