碱性螺旋-环-螺旋(Basic helix-loop-helix,bHLH)转录因子是真核生物中高度保守的一类转录因子,参与调控多种植物致病真菌的分生孢子产生与发育、菌丝形态和致病力等过程。链格孢(Alternaria alternata)侵染烟草引起的赤星病是烟草生产上的一种重要的叶部病害,条件适宜时可引起暴发性危害,导致烟叶品质下降,香气质差,香气量少,刺激性和杂气增加,已成为烟草优质烟叶生产的一大障碍。本研究从链格孢中克隆了bHLH转录因子家族,共得到12个基因,分别命名为AabHLH1~AabHLH12。分析发现这12个bHLH转录因子基因编码氨基酸长度差异较大,且同源性很低,但它们都存在一个共同的bHLH结构域,且该结构域位置不固定,有些分布在氨基端,有些分布在中间位置,还有的距离羧基端更近。利用Linear minimum element法和PEG介导的原生质体转化方法获得了AabHLH1~AabHLH4的基因插入突变体(M1~M4),并对四个突变体进行了回补。通过对比各突变体与野生菌和回补体之间的差异,进行了AabHLH1~AabHLH4四个基因初步的功能分析,结果如下:(1)AabHLH1基因全长1650 bp,无内含子,编码一个549个氨基酸的蛋白;AabHLH2基因全长396 bp,无内含子,编码一个131个氨基酸的蛋白;AabHLH3基因全长858bp,含有一个99 bp的内含子,编码一个549个氨基酸的蛋白;AabHLH4基因全长1317bp,无内含子,编码一个438个氨基酸的蛋白。(2)AabHLH1~AabHLH4四个基因均参与调控链格孢的菌落表型和生长。M1菌落颜色变深,气生菌丝变弱,生长速度降低;M2菌落在PDA上菌丝层变厚,生长速度增加,在MM上菌丝层显著变薄,生长速度较野生菌降低;M3菌落颜色变浅,菌丝层变薄,生长速度略低;M4菌落在PDA上颜色变深,生长速度增加,在MM上颜色较浅,生长速度降低。(3)AabHLH1~AabHLH4四个基因均参与调控链格孢的产孢过程,但影响的阶段不同。AabHLH1基因影响了链格孢产孢和萌发,表现为分生孢子产量降低,萌发时间推迟,萌发率降低,部分孢子喙变长;AabHLH2基因影响了链格孢分生孢子的萌发,表现为分生孢子萌发时间稍有推迟;AabHLH3基因影响了链格孢产孢和萌发,表现为分生孢子产量降低,萌发时间延迟,且自8 h后停止萌发,芽管长度缩短,萌发率降低;AabHLH4基因影响了链格孢的产孢和萌发,表现为分生孢子产量增加,菌丝出现节间变短、膨大的现象。(4)AabHLH1~AabHLH4四个基因均参与调控链格孢的黑色素含量。M1~M3菌落黑色素含量均有不同程度的降低,而M4菌落黑色素含量显著升高。(5)AabHLH1~AabHLH4四个基因均参与调控对非发酵型碳源的利用能力。M1~M4菌落在1%乙醇非发酵型碳源培养基上的生长受到抑制,在1%L-阿拉伯糖和1%D-木糖非发酵型碳源培养基上M1~M4的生长均得到促进。(6)AabHLH1~AabHLH4四个基因均参与调控毒素毒力及致病性。M1~M4毒素毒力与野生菌相比均有所降低,其中M4毒力明显低于野生菌;4株突变体致病性也比野生菌低,其中M2致病性严重降低,M3几乎丧失全部致病性。(7)AabHLH1~AabHLH4四个基因均参与调控胁迫应答。M1菌落对盐胁迫和渗透胁迫的耐受性均高于野生菌与回补体;M2菌落对盐胁迫的耐受性较低,而对渗透胁迫的耐受性则稍高;M3菌落对盐胁迫的耐受性较野生菌较低,对渗透胁迫的耐受性与野生菌基本一致;M4菌落对盐胁迫和渗透胁迫的耐受性均比野生菌低。由此可以推测,AabHLH1~AabHLH4基因均参与了调控链格孢的色素、菌丝形态、分生孢子的产生及萌发、营养生长、对非发酵型碳源的利用力、胁迫应答、毒素毒力及致病力的过程。