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神经胶质瘤是最常见的神经外胚层来源的颅内恶性肿瘤。目前尽管采用手术、放疗和化疗在内的综合治疗，胶质瘤患者仍面临着低生存率和高复发率。因此，迫切需要找到一种新的有效安全的治疗手段。多篇文献报道，Robo1蛋白在胶质瘤中呈过表达，其表达水平较正常脑组织中明显上调，这使其适合作为胶质瘤的特异性靶点。近年来，CD19-CAR-T细胞在治疗血液系统肿瘤患者方面取得了巨大的进步，为肿瘤患者带来了希望，但在治疗实体瘤方面因效果差、副作用多仍不乐观。NK细胞是固有免疫系统的效应细胞。NK细胞不需要抗原预先致敏即可发挥其强大的抗肿瘤作用，并且不受MHC限制性。然而，许多肿瘤细胞常常通过高表达MHCI类分子、分泌免疫抑制性因子等方式获得免疫逃逸的能力。所以，需要引入CAR修饰NK细胞并引导NK细胞对肿瘤细胞的靶向性以达到靶向抗肿瘤的目的。据此，本试验构建了Robo1-CAR-NK-92细胞并比较其与NK-92细胞在体外对胶质瘤细胞的杀伤效果。为了进一步优化Robo1-CAR-NK-92细胞的培养条件，本试验测试了用不同组合的IL-15，IL-21和地塞米松分别处理NK-92细胞及Robo1-CAR-NK-92细胞3天对二者的增殖，活性及杀伤能力的影响。 目的: 研究Robo1-CAR-NK-92细胞与NK-92细胞在体外对胶质瘤细胞的杀伤效果，并测试在培养基中添加IL-15，IL-21和地塞米松对NK-92细胞及Robo1-CAR-NK-92细胞的增殖，活性及杀伤的影响以进一步优化其培养条件。 方法: 1.用慢病毒转染的方法构建Robo1-CAR-NK-92细胞后分选扩增，并用RT-PCR及流式细胞术检测Robo1-CAR-NK-92细胞的转染效果。 2.用流式细胞术检测Robo1在AsPC-1，U-87 MG和U251细胞上的表达。 3.用体外杀伤试验和活细胞成像的方法检测在不同的效靶比下Robo1-CAR-NK-92及NK-92细胞对AsPC-1，U-87 MG及U251细胞的体外杀伤效果。 4.用流式多重微珠阵列法检测Robo1-CAR-NK-92及NK-92细胞在效靶比为0.5∶1时杀伤U-87 MG细胞过程中分泌的细胞因子含量。 5.用台盼蓝染色和活细胞自动计数仪经25ng/mL的IL-15，25ng/mL的IL-21，25ng/mL的IL-15+25ng/mL的IL-21，25ng/mL的IL-15+50nM的地塞米松，25ng/mL的IL-21+50nM的地塞米松，25ng/mL的IL-15+25ng/mL的IL-21+50nM的地塞米松分别处理3天的Robo1-CAR-NK-92及NK-92细胞的计数、活性率。 6.用测定体外杀伤率和活细胞成像的方法检测经上述处理3天的Robo1-CAR-NK-92及NK-92细胞在效靶比为0.5∶1时对U-87 MG细胞的体外杀伤效果。 结果: 1.构建Robo1-CAR-NK-92细胞并经分选扩增后RT-PCR检测可见其阳性表达，流式细胞术检测其阳性率为98.89％。 2.流式细胞术检测结果显示Robo1在AsPC-1，U-87 MG及U251细胞上表达的阳性率分别为1.89％，88.14％，98.75％。 3.在不同的效靶比下，Robo1-CAR-NK-92细胞对AsPC-1细胞的杀伤率与NK-92细胞相比未见显著差别（P＞0.5）。在不同的效靶比下，Robo1-CAR-NK-92细胞对U-87 MG，U251细胞的杀伤率明显高于NK-92细胞(P＜0.5)。 4.Robo1-CAR-NK-92细胞在效靶比为0.5∶1时杀伤U-87 MG细胞过程中分泌的IL-6，IL-10，TNF-α和IFN-γ均较NK-92细胞明显增高(P＜0.5)。 5.与对照的NK-92及Robo1-CAR-NK-92细胞相比，白介素对NK-92细胞的增殖和杀伤无明显影响(P＞0.5)。IL-15增强Robo1-CAR-NK-92的增殖和活性(P＜0.5)而IL-21则起相反作用（P＜0.5），二者联用对Robo1-CAR-NK-92细胞能抑制Robo1-CAR-NK-92细胞的增殖(P＜0.5)，但对其活性无明显影响(P＞0.5)。IL-21和IL15联合IL-21增强NK-92和Robo1-CAR-NK-92细胞的杀伤能力(P＜0.5），而IL-15的处理对二者的杀伤能力无明显影响(P＞0.5)。 6.与仅用白介素处理的NK-92及Robo1-CAR-NK-92细胞相比，地塞米松联合白介素增强NK-92和Robo1-CAR-NK-92细胞的增殖和活性（P＜0.5），但抑制NK-92和Robo1-CAR-NK-92细胞的杀伤能力(P＜0.5)，除IL-15和地塞米松不影响Robo1-CAR-NK-92细胞的杀伤能力外(P＞0.5)。 结论: 1.Robo1-CAR-NK-92细胞在体外对胶质瘤细胞具有强大的靶向杀伤能力。 2.IL-15联用地塞米松处理Robo1-CAR-NK-92细胞3天是在本次实验条件下体外增殖Robo1-CAR-NK-92细胞的最适的培养方案。