目的:糖尿病肾病（Diabetic kidney disease,DKD）是糖尿病的慢性并发症,也是引起慢性肾病的主要病因,严重影响患者的生活质量及生存率。糖尿病肾病发生发展过程中出现肾小管上皮细胞间质转分化,确切的机制仍未完全阐明。含F-盒子/WD重复域蛋白7（F-box and WD repeat domain-containing 7,FBXW7）是最大的E3泛素连接酶家族Skp1-Cullin1-F-box（SCF）复合物的重要组成部分,具有多种功能。本研究拟采用糖尿病小鼠和体外培养的人肾小管上皮细胞（human renal tubular cell lines,HK2）,探究FBXW7对肾小管上皮细胞转分化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）的影响。方法:1.Western blot和免疫组化检测糖尿病小鼠肾脏中FBXW7的表达雄性CD1小鼠随机分为正常对照组（Control组）、2个月糖尿病组（2 months DM组）和4个月糖尿病组（4 months DM组）。糖尿病模型小鼠采用单次腹腔大剂量（150mg/kg）注射链脲佐菌素（streptozotocin,STZ）随机血糖≥16.7为构建成功,分别喂养2月和4月后处死小鼠,切取肾脏。Western blot和免疫组化检测糖尿病小鼠肾组织中FBXW7的表达。2.Western blot和免疫荧光检测高糖对HK2细胞FBXW7表达的影响HK2细胞在37℃,含5%CO2的培养箱内用含10%血清及1%青链霉素混合液的DMEM-F12（3:1）培养基进行培养。为探讨高糖对细胞中FBXW7表达的影响,细胞同步化后高糖（40 mmol/L）分别刺激0h、6h、12h、24h、48h和72h。Western blot检测FBXW7蛋白的表达,免疫荧光检测FBXW7的定位和表达。3.Western blot和免疫荧光检测FBXW7对HK2细胞EMT的影响（1）检测过表达FBXW7对正常糖培养的HK2细胞转分化的直接影响。HK2细胞随机分为未转染组、pCMV3空载体对照组和pCMV3-FBXW7-GFP重组表达质粒组。终止培养后,Western blot检测FBXW7、E-cadherin、α-SMA和fibronectin的表达。（2）检测下调FBXW7基因对高糖刺激的HK2细胞转分化的影响。使用High Gene转染试剂将pGenesil-1-FBXW7和pGenesil-1分别转染进HK2细胞,观察FBXW7基因敲除对高糖刺激的HK2细胞转分化的影响,Western blot检测FBXW7、E-cadherin、α-SMA和fibronectin的表达。免疫荧光检测TGF-β1和α-SMA蛋白表达。4.检测FBXW7对KLF5（Sp/Krüpple-like factor 5）蛋白表达的影响（1）检测生理条件下HK2细胞中FBXW7与KLF5存在相互作用。在HK2细胞中转染pCMV3-FBXW7-GFP和pcDNA3.1-Flag-KLF5质粒,48h后收集细胞裂解液。用Flag-Beads结合我们过表达载体上的Flag蛋白,即KLF5,然后通过Western blot的方法检测两者的相互作用。（2）检测过表达FBXW7对HK2细胞KLF5的影响。HK2细胞随机分为未转染组、pCMV3空载体质粒对照组和pCMV3-FBXW7-GFP重组表达质粒组。Western blot和细胞免疫荧光检测KLF5的表达。（3）检测FBXW7对KLF5蛋白表达的影响。将KLF5、FBXW7和Ub的表达质粒分别转染至HK2细胞中,细胞随机分组为:pcDNA3.1-FLAG-KLF5组、pcDNA3.1-FLAG-KLF5+pcDNA3.1-Ub-HA组和pcDNA3.1-FLAG-KLF5+pcDNA3.1-Ub-HA+pCMV3-FBXW7-GFP组,转染48h后Western blot检测KLF5蛋白表达。（4）检测MG132对FBXW7过表达引起的KLF5下调的影响,HK2细胞随机分pCMV3-FBXW7-GFP组和pCMV3-FBXW7-GFP+MG132组,MG132处理12h后Western blot检测KLF5蛋白的表达。5.Western blot和免疫荧光检测上调KLF5对FBXW7过表达导致的HK2细胞EMT的影响（1）检测过表达KLF5对高糖刺激的HK2细胞转分化的影响。将KLF5表达质粒和空白质粒分别转染入HK2细胞,细胞随机分为高糖+空白质粒转染组（high glucose+pcDNA3.1）,高糖+KLF5质粒转染组（high glucose+pcDNA3.1-FLAG-KLF5）,终止培养后Western blot检测E-cadherin、α-SMA、fibronectin和TGF-β1蛋白表达,免疫荧光检测α-SMA的表达。（2）检测上调KLF5对过表达FBXW7基因导致的HK2细胞转分化的影响。细胞随机分组为:未转染组、空载体对照组、pCMV3-FBXW7-GFP质粒转染组和pCMV3-FBXW7-GFP+pcDNA3-FLAG-KLF5质粒转染组,终止培养后,Western blot检测KLF5、E-cadherin、α-SMA、fibronectin和TGF-β1表达,免疫荧光检测E-cadherin和α-SMA表达。结果:1.糖尿病小鼠肾小管上皮细胞FBXW7的表达免疫组化结果显示糖尿病组与正常对照组相比,糖尿病组小鼠肾脏中的FBXW7表达增多。Western blot检测结果同样显示,糖尿病组小鼠肾皮质组织中FBXW7蛋白表达与正常对照组相比增高,2月和4月糖尿病小鼠肾小管中FBXW7表达分别增高了1.43倍和4.2倍（P<0.05）。2.高糖对HK2细胞中FBXW7蛋白的表达影响Western blot结果显示,高糖刺激6h组FBXW7的表达升高并达到峰值,比高糖刺激0h组的增长了1.45倍（P<0.05）。免疫荧光结果显示,FBXW7主要定位于HK2细胞的胞浆,高糖处理6h的荧光强度明显升高于0h的细胞。3.FBXW7对HK2细胞EMT的影响（1）过表达FBXW7对正常糖培养的HK2细胞转分化的直接影响。Western blot结果显示,在正常糖培养的HK2细胞中,pCMV3-FBXW7-GFP组与pCMV3空载体对照组相比FBXW7蛋白表达升高了2.00倍（P<0.05）。转分化相关指标E-cadherin表达降低55.6%,α-SMA和fibronectin表达分别增加了3.63倍和1.41倍（P<0.05）。（2）下调FBXW7基因对高糖刺激的HK2细胞转分化的影响。Western blot结果显示pGenesil-1-FBXW7组与pGenesil-1组相比,FBXW7的表达量降低了79.3%（P<0.05）。转分化相关指标E-cadherin水平升高了1.25倍,α-SMA和fibronectin水平分别降低54.7%和76.8%（P<0.05）。免疫荧光检测结果显示HK2细胞中pGensilpGenesil-1-FBXW7组与pGenesil-1组相比,TGF-β1和α-SMA的荧光强度降低。4.FBXW7对KLF5蛋白表达的影响（1）免疫共沉淀结果显示对照组中Flag-Beads并没有结合FBXW7,排除了Beads与FBXW7的非特异性结合。而当使用Beads结合Flag后,FBXW7也在Beads结合的蛋白中。说明FBXW7和KLF5在生理条件下有相互作用。（2）过表达FBXW7对HK2细胞KLF5的影响。Western blot结果显示,与pCMV空载体组相比,pCMV-FBXW7-GFP组中KLF5表达降低了58.1%（P<0.05）。免疫荧光检测结果显示,pCMV-FBXW7-GFP组KLF5的荧光强度降低。（3）FBXW7对KLF5蛋白表达的影响。Western blot结果显示,Ub的过表达促进了KLF5蛋白的降解,与单纯转染Ub质粒转染组相比,FBXW7+Ub质粒转染组KLF5表达降低了45%（P<0.05）。（4）MG132对FBXW7过表达引起的KLF5下调的影响。Western blot结果显示,pCMV3-FBXW7-GFP+MG132组与pCMV3-FBXW7-GFP组相比,KLF5蛋白表达增加了1.73倍（P<0.05）。5.上调KLF5对FBXW7过表达导致的HK2细胞EMT的影响（1）过表达KLF5对高糖刺激的HK2细胞转分化的影响。Western blot结果显示,在高糖培养的HK2细胞中转染pcDNA3.1-FLAG-KLF5组与pcDNA3.1空白质粒组相比,KLF5蛋白的表达量增加了2.03倍（P<0.05）,转分化相关指标E-cadherin表达增加了98%,TGF-β1、α-SMA和fibronectin的表达分别降低了63.4%、64.1%和72.7%（P<0.05）。免疫荧光检测结果显示pcDNA3.1-FLAG-KLF5组与pcDNA3.1空白质粒组相比α-SMA荧光强度降低。（2）上调KLF5对过表达FBXW7基因导致的HK2细胞转分化的影响。Western blot结果显示,pCMV3-FBXW7-GFP+pcDNA3.1-FLAG-KLF5组与pCMV3-FBXW7-GFP组相比,TGF-β1、α-SMA和fibronectin的表达分别降低了82.3%、64.5%和51%,E-cadherin表达增加了91.5%（P<0.05）。免疫荧光检测结果显示,KLF5过表达逆转了E-cadherin蛋白在转染pCMV3-FBXW7-GFP细胞中转染组的低表达,KLF5过表达可显著抑制α-SMA在转染pCMV3-FBXW7-GFP细胞中转染组的高表达。结论:1.糖尿病小鼠肾小管上皮细胞和高糖刺激的HK2细胞中FBXW7的表达升高。2.高糖刺激的HK2细胞FBXW7表达上调,介导了细胞转分化过程。3.过表达KLF5可以逆转FBXW7过表达导致的肾小管上皮细胞转分化。