论文部分内容阅读
早期胚胎发育过程中,胚胎基因表达调控逐渐从母源调控转换为胚胎调控的一个关键时期称为母源胚胎转换。这个过渡需要整个胚胎内的胚胎基因组的激活,即EGA。在EGA过程中,母源转录本迅速降解,而胚胎基因则被激活。体细胞克隆胚胎发育过程中,胚胎基因组不能完全激活是影响克隆胚胎发育潜能的重要因素。最新研究表明,长链非编码RNA(lncRNA)在表观遗传修饰、基因表达调控中发挥重要作用。在小鼠早期胚胎的研究中证明,lncRNA是EGA过程的一类关键调控因子。筛选和研究lncRNA在山羊早期胚胎和体细胞克隆胚胎中的作用,对解析山羊早期胚胎发育过程中胚胎基因组激活的调控机制,提高克隆胚胎发育效率都具有重要意义。本研究分别收集体外受精2细胞(IVF-2c)胚胎、体外受精8细胞(IVF-8c)胚胎、核移植8细胞(SCNT-8c)时期的胚胎各15枚进行胚胎转录组测序并进行差异表达分析,筛选出差异表达lncRNA,并查找预测靶基因的功能,通过定量PCR验证表达,筛选到IVF-8c高表达而SCNT-8c中低表达的lncRNA3720。通过基因敲除和过表达试验验证其对胚胎发育以及对靶基因和胚胎发育关键基因表达的影响;构建其重组载体和过表达细胞模型,细胞水平测序分析lncRNA3720过表达后的差异表达基因,并且在细胞水平检测组蛋白甲基化水平的变化;最后在胚胎水平验证其对核移植胚胎发育率的影响。获得如下研究结果:(1)RNA-seq显示lncRNA在山羊早期胚胎中大量表达,且体外受精8细胞时期的转录本表达量高于体外受精2细胞和核移植8细胞时期,证明了8细胞时期有大量转录本被激活,典型合子基因Zscan4也在其中,GO富集显示核移植胚胎与体外受精胚胎差异基因主要富集于核酸代谢途径;IVF-8c同IVF-2c及SCNT-8c分别进行差异基因比较,得到了12条差异表达lncRNA。(2)转录组测序和qPCR定量分析显示lncRNA3720在IVF-8细胞期高表达,符合胚胎基因组激活基因的表达模式;干扰试验证明lncRNA3720敲低显著降低了囊胚发育率(P<0.05),但是不影响上下游基因,表明其不是通过顺式调控的方式影响早期胚胎的发育。(3)通过RACE技术成功扩增出lncRNA3720的全长并获得体外转录lncRNA,通过干扰和过表达试验证明,lncRNA3720可以调节合子基因ZSCAN4、EIF1AX的表达,表明lncRNA3720参与部分山羊胚胎基因的激活。(4)成功构建pcDNA3.1(+)-lncRNA3720过表达载体,并转染山羊胎儿成纤维细胞,转录组测序结果得到1071条差异表达基因,其中上调基因362个,下调基因709个;测序数据分析发现lncRNA3720会使OGT的水平下调,而OGT对于H3K27me3的产生是必不可少的,蛋白质印迹Western Blot和免疫荧光染色实验验证,证明lncRNA3720过表达后H3K27me3的水平确实降低;核移植胚胎补偿试验证明,lncRNA3720的过表达可提高核移植胚胎的发育率。综上所述,lncRNA在山羊早期胚胎中大量表达,对维持早期胚胎发育起重要作用,lncRNA对早期胚胎发育的调控可通过调节组蛋白甲基化的水平来调节早期胚胎中相关胚胎基因组激活的基因来实现,解析特定lncRNA在表观遗传调控中的作用,对核移植胚胎发育率的提高具有重要意义。