产α-淀粉酶抑制剂乳酸菌的筛选及活性成分纯化研究

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α-淀粉酶抑制剂(α-amylaseinhibitor)是一种糖苷酶抑制剂,它能够抑制α-淀粉酶的活性,阻碍α-淀粉酶对淀粉等大分子碳水化合物的水解,从而可以降低血糖和血脂等指标。所以α-淀粉酶抑制剂对高血糖、糖尿病、高血脂等疾病的预防和治疗起到很大的作用。乳酸菌是一类公认的对人体十分有益的可食用菌群,具有很多益生功能,目前仍然在挖掘研究更多的新型功能,对于乳酸菌的降血糖功能及其降糖产品的开发也逐渐趋于一个新的热点。本课题通过对实验室现存的乳酸菌进行筛选鉴定,对其产α-淀粉酶抑制剂的发酵条件进行优化,并对产生的抑制剂进行分离纯化和特性研究。主要研究内容如下:(1)产α-淀粉酶抑制剂乳酸菌的筛选及鉴定从实验室保存菌种中对168株乳酸菌进行筛选,初筛得到17株疑似存在α-淀粉酶(猪胰腺)抑制剂的菌种,经过复筛筛选出一株抑制活性最强的菌株Y9-3,其对α-淀粉酶的抑制率达到了 32.54%。1 ml Y9-3发酵液与1.565 mg的阿卡波糖抑制效果相当。通过对Y9-3进行形态特征、生理生化特征实验测定和16S r DNA序列对比及系统进化树分析,得出Y9-3在37℃的条件下恒温培养48 h后可形成清晰的且形态较好的菌落,菌落直径为0.2mm-1.0mm,颜色为乳白色,表面较为光滑且没有其他色素产生。革兰氏染色为阳性,细胞形态为杆状,没有芽孢形成。该菌株能够利用葡萄糖、果糖、阿拉伯糖、乳糖、麦芽糖,不能水解淀粉,也不能使明胶液化,甲基红实验结果显示为阳性,硫化氢、过氧化氢酶实验结果均为阴性。经过在NCBI官网上进行同源性对比以及通过构建系统进化树进行分析最终确定乳酸菌Y9-3为植物乳杆菌。(2)产α-淀粉酶抑制剂乳酸菌发酵优化条件研究通过对碳源和氮源的筛选,碳源为葡萄糖时对α-淀粉酶的抑制活性最高,达到了 32.04%,氮源为酵母膏时α-淀粉酶的抑制率最高,达到了 32.41%。单因素试验最终确定最佳接种量为4%,最佳发酵时间为48 h,最佳发酵温度为36℃,最佳装瓶量为110 ml,最佳初始pH为6.5。在上述条件下α-淀粉酶抑制率最高。正交结果确定最佳的发酵条件最优组合为:初始pH为6.5,装瓶量为110ml,发酵温度为38℃,发酵时间为48h。在此条件下菌发酵上清液对α-淀粉酶的抑制活性最高,达到了47.25%。比优化前的酶抑制率提高了 42.13%。(3)α-淀粉酶抑制剂分离纯化方法建立的初步研究对发酵上清液进行活性成分的筛选最终得到正丁醇有机相中的α-淀粉酶抑制率最高为84.42%。进行SephadexLH-20层析时从第12管开始,抑制剂活性成分开始被洗脱出来,在第23管抑制率达到了最高。将得到的具有抑制活性的流份进行合并浓缩测得其抑制率为89.36%,将制备液相得到的活性峰进行α-淀粉酶抑制率的测定,选择抑制活性最高的峰进行LC-MS/MS的测定,经过对抑制剂进行化学成分的分析及结合质谱图,推测该抑制剂的成分可能为蛋白质和糖类化合物的混合物,而且是一种分子量较小的物质。对其理化性质的研究发现温度对α-淀粉酶抑制剂的影响作用不是很大,在温度为45℃时,其对α-淀粉酶的抑制活性最高,抑制率达到了88.23%,而pH对α-淀粉酶的抑制率影响较大,在pH为5时淀粉酶的抑制率达到最高,为88.69%。
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