椎间盘退变是脊柱退行性疾病发生的根本因素,是临床骨科脊柱的常见病、多发病,是引起颈肩部、腰腿部疼痛麻木的主要原因。呈胶状质的髓核位于中央,外围有纤维环所围绕固定,以及和上下缘终板一起构成了完整的椎间盘,其弹性作用一定程度上缓解了外界冲击对于脊柱的伤害,并且维持了有效的椎间隙高度。椎间盘终板主要由软骨组织构成,而软骨组织的形态功能主要是由其成分中的蛋白多糖和胶原所维持的。椎体终板与上下椎体末端相接,位于椎间盘的上下两端,是椎间盘与相邻上下椎体的过渡性结构,可以分为上位终板和下位终板,是一种主要由软骨和骨成分组成的纤维薄状结构,椎间盘终板主要由软骨组织构成,而软骨组织的形态功能主要是由其成分中的蛋白多糖和胶原所维持。相关研究发现,机械刺激是促使软骨细胞增殖、分化及其凋亡和维持结构完整性的重要因素,而前期研究发现,异常应力刺激将会使相关基因表达改变,从而影响软骨细胞中II型胶原、蛋白多糖含量及软骨新陈代谢,加速椎间盘退变的发生。前期通过采用生物信息学技术对公共基因芯片数据库中椎间盘退行性疾病相关基因芯片进行挖掘发现,差异表达基因主要富集在炎症反应、凋亡过程的正调节、氧化应激反应的内在凋亡信号通路、凋亡细胞清除的阳性调节、Wnt信号通路参与体细胞发生等生物学过程;而且显示异常力学因素可通过代谢途径、PI3K-Akt信号通路、p53信号通路、调控干细胞多能性的信号通路、MAPK信号通路、氨基酸生物合成、Wnt信号通路、TGF-β信号通路等8条主要信号通路发挥诱导椎间盘退变的作用,故我们推测Wnt/β-catenin信号通路在椎间盘推行性疾病过程中扮演重要角色。在前期构建离体脊柱节段模型时发现,HE染色显示,中压力组髓核细胞数量相对较多且排列规整,随着时间的延长,1kg压力下Wnt-3α、β-catenin、蛋白多糖、II胶原等蛋白表达水平相对较高,能够明显缓解椎间盘退变进程,而低于或高于该压力的异常负载,其相关指标均逐渐降低,进一步加快了椎间盘退变的速度。依据中医基础理论,椎间盘退行性疾病主要的病因病机为肝肾不足,血淤气滞,故补肾活血这一治则是临床上治疗该类疾病的主要方法。我院朱立国教授依据我国古代医书---《太平惠民和剂局方》中青娥丸的基础上,并且结合自己多年临床经验,在其方上运用辩证论治方法,将核桃仁、大蒜两位中药换成怀牛膝、威灵仙、木瓜、丹参四位中药,从而形成组方为:杜仲15g、补骨脂10g、怀牛膝10g、丹参12g、威灵仙10g、木瓜9g的补肾活血基本方。全方补肾健脾以治本、活血通络以治标。本课题组前期临床研究发现,补肾活血方在临床上治疗椎间盘源性腰痛具有良好的疗效;并且基础研究发现,补肾活血方可刺激椎间盘终板软骨细胞合成、分泌蛋白聚糖和II型胶原,但其对椎间盘退行性变的具体影响和机制尚不明确。本研究将通过构建离体脊柱节段模型,观察补肾活血方对椎间盘退变和终板软骨细胞以及Wnt/β-catenin信号通路的关系,旨在从细胞分子水平阐释其调控终板软骨细胞诱导/延缓椎间盘退行性变的效应特点及作用机制。研究目的:观察补肾活血方对压力下离体兔脊柱运动节段椎体终板的影响,阐明其调控终板软骨细胞延缓椎间盘退行性变的效应特点及作用机制。研究方法:将40只健康新西兰兔采用随机数字表法分为:模型对照组、中药组、中药抑制组、中药激动组,每组10只。其中对照组:模型+培养液+无药血清;中药组:模型+培养液+补肾活血方含药血清;中药激动剂组:模型+培养液+SB216763+补肾活血方含药血清。中药抑制剂组:模型+培养液+ICG001+补肾活血方含药血清。培养液中含有20%胎牛血清、25 μg/ml抗坏血酸、50 mg/mL庆大霉素,并用NaCl将细胞培养液的渗透压调整到410mOsm/kg,各组置于5%C02、37℃恒温培养箱进行离体培养,隔天换液。离体环境下培养14天;采用HE染色病理形态学方法评估补肾活血方对椎间盘退行性变程度的影响;采用免疫组化法检测补肾活血方对椎间盘终板软骨中蛋白多糖、II型胶原和VEGF含量的影响;采用荧光定量聚合酶链式反应法(RT-PCR)检测补肾活血方对Wnt-3α、GSK-3 β、β-catenin、VEGF表达的影响;采用Western Blot检测补肾活血方对椎间盘终板软骨组织中Wnt-3 α、GSK-3 β、β-catenin、VEGF等蛋白表达水平的影响;研究结果:(1)药物对椎间盘退变的影响:HE染色显示,与对照组相比，中药组软骨细胞数量相对较多,随着时间的延长,两组细胞外基质均逐渐减少,但对照组减少幅度大于中药组,软骨层逐渐出现断裂,排列松散,对照组更为明显;RT-PCR结果显示,同一组别不同时间点相比,对照组及中药组Wnt-3α、GSK-3β、β-catenin、VEGF mRNA表达水平逐渐降低,差异具有统计学意义(P<0.05);同一时间点不同组别相比,0天时各组间差异无统计学意义(P>0.05),VEGF mRNA表达在第1天时与对照组相比无统计学意义(P>0.05),其余各组间在1天后均有显著差异(P<0.05),且1天后中药组Wnt-3α、β-catenin mRNA表达水平相对较低,但GSK-3 β、VEGF mRNA表达水平相对较高;Western Blot结果显示,同一组别不同时间点相比,对照组及中药组Wnt-3α、GSK-3β、β-catenin蛋白表达水平先升高后降低,VEGF蛋白表达逐渐降低,差异具有统计学意义(P<0.05);同一时间点不同组别相比,0天时各组间差异无统计学意义(P>0.05),1天后各组间有显著差异(P<0.05),且1天后中药组Wnt-3α、VEGF蛋白表达水平相对较高,但GSK-3 ββ-catenin蛋白表达水平相对较低。(2)药物延缓椎间盘退变机制:免疫组化法检测结果显示,同一组别不同时间点相比,对照组及中药组蛋白多糖、VEGF含量逐渐降低,II型胶原含量先升高后降低,差异具有统计学意义(P<0.05);同一时间点不同组别相比,0天时各组间差异无统计学意义(P>0.05),1天后各组间有显著差异(P<0.05),且1天后中药组蛋白多糖、II型胶原、VEGF含量相对较高,蛋白多糖、II型胶原及VEGF含量激动剂组在3天时有少量增加,与中药组相比,激动剂组和抑制剂组差异均有统计学意义(P<0.05);RT-PCR结果显示,Wnt-3α基因表达激动剂组和抑制剂组均降低,且抑制剂组表达水平相对较低,与中药组之间均无统计学差异(P>0.05),GSK-3β基因表达激动剂组和抑制剂组均降低,且激动剂组表达水平相对较低,激动剂组与中药组之间有明显差异(P<0.05),β-catenin基因表达激动剂组和抑制剂组均降低,且激动剂组表达水平相对较低,两组与中药组之间均有显著差异(P<0.05),VEGF基因表达激动剂组和抑制剂组均降低,且抑制剂组表达水平相对较低,两组与中药组之间均有显著差异(P<0.05);Western Blot结果显示,Wnt-3 α蛋白表达量激动剂组和抑制剂组与中药组之间均无统计学差异(P>0.05),GSK-3β表达量激动剂组有明显差异(P<0.05),而β-catenin和VEGF蛋白表达量抑制剂组有明显差异(P<0.05),而激动剂组无明显差异(P>0.05)。研究结论:(1)补肾活血方含药血清短期内能一定程度上延缓椎间盘退变,为补肾活血方对椎间盘退变的早期防治作用提供了依据;(2)补肾活血方可以通过介导Wnt/β-catenin信号通路调控终板软骨细胞延缓椎间盘退变进程。