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【目的】大多数间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)生长在低氧微环境中。低氧条件下细胞发生代谢重组,其代谢模式由氧化磷酸化向糖酵解转变,与此同时,三羧酸循环(tricarboxylic acid cycle,TCA cycle)的代谢中间物琥珀酸(succinate)在胞质内堆积。已有证据表明,succinate可以在胞质内通过稳定缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)介导低氧诱导基因的转录。本研究的目的是探讨TCA循环的天然代谢物succinate的外源性添加是否能模拟低氧条件,在常氧下介导细胞代谢重组,进而促进人牙周膜干细胞(human periodontal ligament stem cells,hPDLSCs)的增殖、迁移和成骨。【方法】在氧饱和度为1%的低氧条件及1 mM、5 mM、25 mM外源性succinate处理条件下,分别通过细胞增殖实验、划痕实验、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)/茜素红S(alizarin red S,ARS)染色探究低氧对h PDLSCs增殖、迁移和成骨的影响。通过q PCR和Western blot方法,分析增殖和成骨相关基因及蛋白在常氧和低氧条件下的表达差异,如细胞周期蛋白D1(Cyclin D1,CCND1)、细胞周期蛋白D3(Cyclin D3,CCND3)、细胞周期蛋白B1(Cyclin B1,CCNB1)骨钙蛋白(osteocalcin,OCN)、ALP、胶原酶I(collagen-I,COL-1)等的表达是否存在差异。为了证明低氧和外源性succinate处理后胞内的succinate堆积,使用琥珀酸化学比色法分别测定2 h、6 h、12 h和24 h常氧和低氧条件下的细胞内succinate浓度。为了探究低氧和外源性succinate处理后h PDLSCs的代谢改变,通过ELISA检测琥珀酸脱氢酶(succinate dehydrogenase,SDH)活性变化,通过q PCR和Western blot检测糖酵解和TCA循环的相关基因及蛋白的表达变化,包括己糖激酶2(hexokinase 2,HK2)、2,6-二磷酸果糖激酶3(6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-biphosphatase 3,PFKFB3)和SDH。为了证明胞质内堆积的succinate可以通过抑制脯氨酸氢化酶(prolyl hydroxylases,PHD)稳定低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α),通过Western blot检测对照组、低氧组与外源性succinate处理组PHD2及HIF-1α的蛋白表达含量。为了进一步证明低氧和外源性succinate介导的h PDLSCs的增殖、迁移和成骨与HIF-1α密切相关,通过HIF-1α的抑制剂BAY 87-2243预处理细胞3 h后,用q PCR检测对照组、低氧及外源性succinate处理后细胞增殖的相关基因表达含量。为了分析琥珀酸受体1(succinate receptor 1,SUCNR1)对于低氧和外源性succinate条件下在影响干细胞增殖过程中的作用,通过琥珀酸化学比色法检测对照组、低氧组和外源性succinate处理组胞外succinate浓度;通过q PCR检测h PDLSCs对照组、低氧组及外源性succinate处理组SUCNR1基因的表达含量;通过sh SUCNR1慢病毒转染h PDLSCs后,通过q PCR检测对照组、低氧及外源性succinate处理后细胞增殖的相关基因表达含量。【结果】低氧组与外源性succinate补充组的细胞增殖实验、划痕实验、ALP/ARS染色实验、q PCR和Western Blot显示,与对照组相比,h PDLSCs增殖能力、迁移能力、成骨能力及增殖、成骨相关基因和蛋白的表达含量相应增加。琥珀酸化学比色法显示,与对照组相比,h PDLSCs在低氧条件及外源性succinate补充下分别于12 h、6 h后胞内succinate浓度开始明显增加;ELISA显示,低氧条件及外源性succinate补充下细胞SDH酶活性受损;q PCR和Western Blot显示,细胞糖酵解相关基因及蛋白的表达含量明显上升,而TCA循环相关基因及蛋白SDH的表达含量在4 h时基因表达上升,24 h时蛋白含量下降。同时,Western Blot显示,低氧及外源性succinate补充组PHD蛋白含量下降,而HIF-1α蛋白含量上升。加入HIF-1α抑制剂后,q PCR显示,与对照组相比,h PDLSCs在低氧及外源性succinate条件下,增殖相关基因的表达含量均下降。与对照组相比,h PDLSCs在低氧条件及外源性succinate补充下胞外succinate浓度均增加,且SUCNR1基因表达含量在两组中均上升。通过慢病毒转染sh SUCNR1后,与Ctrl si RNA组相比,h PDLSCs在低氧条件下增殖相关基因的表达含量明显下降;而在外源性succinate条件下增殖基因的表达与Ctrl si RNA组无明显差别。【结论】低氧及外源性succinate均可以促进h PDLCs的增殖、迁移和成骨;低氧使细胞代谢从氧化磷酸化向糖酵解转变,succinate在胞质中积累并释放到胞外;外源性succinate可以运进细胞内,在常氧条件下介导细胞代谢重组;低氧及外源性succinate通过稳定HIF-1α,改变细胞生理活动;低氧诱导的h PDLCs增殖具有GPR91依赖性,而外源性succinate诱导的增殖涉及GPR91的依赖性和非依赖性途径。