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目的:1.探讨SMAC类似物LCL161及在Caspase酶抑制条件下对乳腺癌耐药细胞的影响;2.探寻SMAC类似物LCL161及在Caspase酶抑制条件下诱导的乳腺癌耐药细胞死亡形式及其关键性蛋白表达的影响。方法:1.CCK-8法检测SMAC类似物LCL161及在Caspase酶抑制条件下对人乳腺癌耐药细胞MCF-7/DDP存活率的影响。2.集落形成实验检测LCL161及在Caspase酶抑制条件下对细胞集落形成的影响。3.Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测LCL161及在Caspase酶抑制条件下作用于MCF-7/DDP细胞24h后对死亡率的影响。4.ATP检测试剂盒检测不同组合药物处理MCF-7/DDP细胞后细胞内ATP水平的变化。5.Western blotting(免疫印迹)方法检测坏死性凋亡相关蛋白(RIP1、RIP3、MLKL、p-MLKL)表达的变化,从而寻找化合物诱导细胞坏死性凋亡的潜在机制。6.免疫荧光法检测LCL161及在Caspase酶抑制条件下处理MCF-7/DDP细胞后坏死性凋亡相关蛋白的定位及表达变化。7.电镜试验观察药物处理后细胞亚显微结构的变化。8.使用Si RNA沉默MCF-7/DDP细胞中RIP3的表达后,CCK-8及流式细胞仪检测LCL161及在Caspase酶抑制条件下对细胞的增殖抑制作用。结果:1.LCL161降低乳腺癌顺铂耐药细胞MCF-7/DDP的存活率结果显示:MCF-7/DDP的细胞死亡率和LCL161作用时间、作用浓度均呈正关关系,即LCL161对MCF-7/DDP的增殖抑制明显增强。与此同时,细胞数量逐渐减少,且细胞形态渐趋于变圆。集落形成试验表明:选用不同的药物浓度LCL161作用于细胞时,随着药物浓度升高,集落形成明显减少。2.在Caspase抑制条件下,LCL161诱导乳腺癌耐药MCF-7/DDP细胞发生更剧烈的细胞死亡结果显示:通过CCK-8结果分析,当不同浓度LCL161分别加入Caspase抑制剂后,细胞死亡率增加;集落克隆试验表明,当加入Caspase抑制剂z-VAD-fmk后,LCL161产生的增殖抑制作用增强,集落形成数目明显减少。3.z-VAD-fmk增强了LCL161诱导的MCF-7/DDP细胞凋亡结果显示:单用Caspase酶抑制剂z-VAD-fmk不能激活MCF-7/DDP细胞凋亡;LCL161能诱导细胞凋亡;当加入Caspase酶抑制剂z-VAD-fmk后,z-VAD-fmk增强了LCL161诱导的细胞凋亡。4.LCL161和z-VAD-fmk联合降低了细胞内ATP水平结果显示:与单用LCL161相比,LCL161和z-VAD-fmk的组合显著降低了MCF-7/DDP细胞内ATP水平。5.RIP1是LCL161在Caspase酶抑制条下诱导产生坏死性凋亡的关键蛋白结果显示:当联用Caspase抑制剂后,LCL161诱导了MCF-7/DDP细胞RIP1蛋白的表达。6.LCL161和z-VAD-fmk在Caspase抑制条件下联合诱导RIP3发生坏死性凋亡结果显示:当联用Caspase抑制剂后,LCL161同时诱导了MCF-7/DDP细胞坏死性凋亡蛋白RIP3、MLKL、p-MLKL蛋白的表达。7.免疫荧光检测到LCL161和z-VAD-fmk联合诱导MCF-7/DDP细胞产生坏死性凋亡蛋白免疫荧光结果显示:当加入LCL161和z-VAD-fmk处理后,MCF-7/DDP细胞质内坏死性凋亡蛋白RIP1和RIP3蛋白表达显著升高。8.电镜试验观察到LCL161和z-VAD-fmk处理后,细胞发生坏死性凋亡电镜结果显示:LCL161和z-VAD-fmk联合处理后,MCF-7/DDP细胞发生了以坏死性凋亡为主的细胞死亡;顺铂处理组MCF-7/DDP细胞表现为凋亡。9.使用si RNA干扰RIP3表达,保护了LCL161和z-VAD-fmk诱导MCF-7/DDP细胞的坏死性凋亡作用结果表明:使用筛选的有效序列沉默RIP3后,LCL161和z-VAD-fmk对MCF-7/DDP细胞的增殖抑制作用减弱了,坏死性凋亡抑制剂Nec-1对MCF-7/DDP细胞的保护作用消失。结论:1.SMAC类似物LCL161能抑制乳腺癌耐药细胞MCF-7/DDP增殖。2.在Caspase抑制条件下,LCL161对MCF-7/DDP细胞抑制效果更好。3.LCL161和z-VAD-fmk通过诱导MCF-7/DDP细胞坏死性凋亡,抑制细胞增殖。4.LCL161和z-VAD-fmk通过诱导MCF-7/DDP细胞坏死性凋亡需要RIP3。