论文部分内容阅读
大肠杆菌（Escherichia coli,E.coli）是自然界中非常常见的原核生物,可感染人和动物。大肠杆菌根据临床致病性和遗传学特性大体上可分为三大类:共生型（Commensal group）、腹泻型（Diarrheal group）和肠外型（Extraintestinal group）。其中肠道外大肠杆菌（Extraintestinal Pathogenic E.coli,ExPEC）可导致人类和农场动物的感染。通常分为禽致病性大肠杆菌（Avianpathogenic E.coli,APEC）,尿道致病性大肠杆菌（Uropathogenic E.coli,UPEC,引起尿道、尿路感染UTI）,新生儿脑膜炎或败血症的大肠杆菌（Newborn meningitic E.coli,NMEC）。在家禽中,APEC菌株引起的局部和全身感染通常称为禽大肠杆菌病,每年给养禽业带来巨大经济损失,并且对人类等哺乳动物具有潜在威胁。因此,APEC的研究对养殖业及公共卫生具有重要意义。噬菌体和细菌在生物学中广泛存在,噬菌体的数量超过细菌的十倍。噬菌体可分为三种类型:裂解性噬菌体,溶原性噬菌体（前噬菌体）和假溶原性噬菌体。对于大多数细菌,其基因组中均含有前噬菌体基因。在细菌病原体中,前噬菌体基因常常编码一些外来基因,并随着细菌一起复制传代,从而可能导致宿主菌对外界环境的适应能力发生变化。前期研究发现APEC菌株DE205B基因组中存在前噬菌体片段,命名为phiv205-3。本研究对phiv205-3进行了完整及单个基因的缺失,以研究该前噬菌体残基对细菌环境适应性的影响。1.前噬菌体残基phiv205-3对禽致病性大肠杆菌DE205B环境适应性及毒力的影响利用Red同源重组技术敲除前噬菌体phiv205-3片段,构建前噬菌体片段缺失株DE205B△phiv205-3,生长曲线测定结果显示,与野生株相比,缺失株生长情况无明显变化。进一步检测野生株和缺失株对酸、碱、高渗和氧化应激的耐受力,结果显示,与野生株相比,缺失株在酸性环境（pH4.0）的存活率下降了 20.6%（P<0.05）,在碱性环境（pH10.0）的存活率下降了 20.3%（P<0.05）,在高渗环境（2.4 MNaCl）的存活率下降了 50.6%（P<0.01）,在氧化应激环境（10 mM H2O2）的存活率下降了 33%（P<0.05）,表明前噬菌体phiv205-3片段缺失导致了宿主细菌对外界环境的耐受力下降。为检测phiv205-3的缺失是否会影响宿主菌的毒力,进行了雏鸡致病力试验,结果显示缺失株与野生株的LD50并没有显著差异,但与野生株相比,缺失株在雏鸡脑中的定殖能力显著降低;细胞粘附和侵袭试验结果显示,缺失株相比于野生株对细胞的粘附与侵袭能力均显著下降,表明phiv205-3的缺失影响了细菌对细胞的粘附、侵袭和在动物体内的定殖能力,但对细菌的毒力并没有产生显著的影响。2.nrdF基因有助于增强禽致病性大肠杆菌DE205B的抗氧化应激能力通过基因序列分析发现phiv205-3编码了 4个氧化应激相关基因nrdE、nrdF、nrdH、nrdI,为研究是否是这些基因影响了宿主菌的抗氧化应激能力,首先用荧光定量PCR方法检测了这些基因的表达量,结果显示nrdF在氧化应激情况下转录水平显著提高（P<0.05）;进一步用 red同源重组方法构建基因缺失株DE205B △nrdE、DE205B△nrdF、DE205B△nrdH和DE205B△nrdI,并检测这些缺失菌株的氧化应激耐受力,结果显示,与野生株相比,缺失株DE205B△nrdF在氧化应激环境（10 mM H2O2）下的存活率下降21%（P<0.05）,而缺失株DE205B△nrdE、DE205B△nrdH和DE205B△nrdI在氧化应激环境下的存活率无显著变化。提示前噬菌体片段编码的nrdF基因有助于增强宿主细菌DE205B氧化应激耐受力。3.prov基因有助于增强禽致病性大肠杆菌DE205B的抗高渗能力基因序列分析中还发现phiv205-3编码了一些与高渗耐受力有关的基因proV和proW。为检测哪些基因在宿主菌的抗高渗能力中发挥作用,首先用荧光定量PCR检测了这些基因在高渗环境下的转录水平,结果显示基因proV与proW在高渗环境下proV转录水平量提高51%（P<0.01）,proW转录水平量提高39%（P<0.05）。进一步构建基因缺失株DE205B△proW和DE205B△proW,并比较它们和野生株在高渗环境下的生长情况,结果显示,与野生株相比,缺失株DE205B△proV和DE205B△proW在高渗透压环境下的生长明显受到抑制,并且在加入甜菜碱的高渗环境中,野生株的生长抑制得到有效缓解,而缺失株的生长抑制并没有明显变化,表明proV和proW有助于提高宿主菌的抗高渗能力。宿主细胞的细胞质对细菌来说是一种高渗环境,因此,通过细胞粘附与侵袭试验检测基因proV和proW对DE205B胞内生长的影响,结果显示,与野生株相比,缺失株DE205B △proV对细胞的侵袭与粘附能力显著降低（P<0.05）,提示proV还有助于增强DE205B对宿主细胞的粘附和侵袭能力。试验结果表明前噬菌体片段phiv205-3通过编码nrdF基因有助于增强宿主细菌DE205B氧化应激耐受力;通过pro V和proW基因提高宿主菌的抗高渗能力,同时proV基因可提高细菌对细胞的侵袭与粘附能力,提示前噬菌体可增强禽致病性大肠杆菌的环境适应能力,有助于宿主菌更好的在环境和动物体内生存。