论文部分内容阅读
研究背景及目的血管内皮功能障碍是糖尿病视网膜病变发生及发展的始动因素之一。内皮祖细胞(Endothelial Progenitor Cell, EPC)可参与出生后血管再生和血管内皮损伤后修复。本实验通过提取糖尿病视网膜病变(Diabetic Retinopathy, DR)患者、单纯糖尿病(Diabetes Mellitus, DM)患者及无糖尿病对照者外周血中内皮祖细胞,进行体外培养后对各组细胞进行流式细胞仪计数,并分别比较迁移、粘附、增殖等功能变化,探讨EPC在糖尿病视网膜病变发病机制中的作用,旨在为早期防治糖尿病视网膜病变提供理论依据,为临床治疗糖尿病视网膜病变开拓思路、提供参考。方法本文随机选取糖尿病视网膜病变患者12例(DR组)、单纯糖尿病患者18例(DM组)和无糖尿病的单纯老年性白内障患者15例作为对照组,采用Ficoll密度梯度离心法收集外周血单个核细胞(Mononucl ear cell, MN C),采用体外培养技术成功分离、培养外周血EPC,观察EPC生长情况,并利用免疫荧光技术鉴定及分析EPC具有分化为内皮细胞的特性。体外培养10天后,应用流式细胞术鉴定CD34/CD133阳性细胞百分比,并分别对各组细胞采用二苯基四氮唑嗅盐(MTT)比色法、粘附能力测定实验和Transwell实验检测EPC的增殖、粘附和迁移能力,进行统计学分析。结果1.EPC培养：新分离的外周血单核细胞呈圆形,透亮,悬浮于培养基,台盼蓝染色活细胞>99%。体外培养第3天可见贴壁细胞体积增大,梭形细胞增加。第7天可见贴壁细胞呈集落样生长,培养至第10天贴壁细胞大多呈梭形,并可见条索状结构,培养至第20天可见贴壁细胞呈铺路石样。2.EPC鉴定：细胞培养第10天,荧光染色后在荧光显微镜下观察。显示红色荧光的为Dil-ac-LDL阳性细胞,显示绿色荧光的为FITC-UEA-1阳性细胞,显示橙色荧光为Dil-ac-LDL与FITC-UEA-1双阳性细胞,倒置荧光显微镜下记数双阳性细胞>95%。3.EPC表型检测：流式细胞仪鉴定第10天的贴壁细胞CD34、CD133阳性率为对照组(45.192±1.287)%,DM组(30.131±3.245)%,DR组(37.375±2.501)%。DM组及DR组与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05),并且DR组EPC阳性率高于DM组,二者差异有统计学意义(P<0.05)。4.EPC增殖能力(OD值)比较：对照组0.330±0.047,DM组0.225±0.042,DR组0.120±0.029。DM组及DR组与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05),并且DR组EPC阳性率高于DM组,二者差异有统计学意义(P<0.05)。5.EPC粘附能力(细胞数/×200视野)比较：对照组76.400±7.503,DM组51.167±6.646,DR组26.500±7.853。DM组及DR组与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05),并且DR组EPC阳性率高于DM组,二者差异有统计学意义(P<0.05)。6.EPC迁移能力(细胞数/×200视野)比较：对照组23.600±6.504,DM组20.833±4.491,DR组12.000±2.944。对照组虽略高于DM组,但是差异无统计学意义(P>0.05),DR组与对照组相比,二者有统计学差异(P<0.05),DR组与DM组相比,二者有统计学差异(P<0.05)。结论1.外周血内皮祖细胞经培养后,糖尿病视网膜病变组和糖尿病组内皮祖细胞阳性率较对照者减少,而糖尿病视网膜病变组内皮祖细胞阳性率较糖尿病组增高。糖尿病视网膜病变组内皮祖细胞的增殖、粘附和迁移能力受损。2.外周血内皮祖细胞数量减低和功能受损可能是糖尿病视网膜病变发生和发展的关键环节。3.改善外周血内皮祖细胞功能及数量可能成为糖尿病视网膜病变预防与治疗的一个新靶点,为糖尿病视网膜病变的预防与治疗提供了新思路。