论文部分内容阅读
目的通过建立大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型,观察叶酸(folic acid,FA)对局灶性脑缺血损伤大鼠的保护作用,并探讨其保护作用机制。方法成年雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠随机分为假手术(sham operation,SO)、大脑中动脉栓塞模型(MCAO)、缺血+叶酸低剂量(MCAO+LFA)和缺血+叶酸高剂量(MCAO+HFA)4组。SO组和MCAO组灌胃生理盐水10ml/kg·bw·d。MCAO+LFA组和MCAO+HFA组分别灌胃叶酸溶液4mg/kg·bw·d、12mg/kg·bw·d。除SO组外,其他三组均于灌胃28d后采用线栓法制作MCAO模型。术后24h观察大鼠体征,进行神经功能评分,并采用氯化四氮唑(tetrazolium chloride,TTC)染色法测定大鼠脑梗死体积;术后3d采用Y迷宫法检测造模后大鼠学习记忆能力;采用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记(terminal-deoxynucleotidyltransferase mediated nick end labeling,TUNEL)法检测造模后7d脑组织神经细胞凋亡率;采用化学发光法、高效液相色谱法(high performance liquidchromatography,HPLC)和抗氧化检测试剂盒分别检测叶酸补充前、补充28d后(造模前)和造模后3d大鼠血清叶酸含量、血浆同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)水平及血清中丙二醛(maleic dialdehyde,MDA)含量、超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)活性水平。为探讨缺血性脑损伤时细胞外信号调节激酶(extracellular signal regulatedkinases,ERK)通路激活特征和脑缺血损伤后叶酸诱导的磷酸化ERK1/2蛋白表达变化规律,采用western blot方法分别检测MCAO组造模后各时间点(1d、3d、7d、14d)pERK1/2在大鼠缺血脑组织中表达的时程变化,以及SO、MCAO、MCAO+LFA和MCAO+HFA四组造模后3d、7d、14d各组脑组织中pERK1/2蛋白表达情况,并采用免疫荧光染色法检测SO、MCAO、MCAO+LFA和MCAO+HFA四组造模7d后各组脑组织ERK1/2和pERK1/2蛋白分布情况及表达水平。此外,为探讨ERK信号通路是否参与叶酸诱导的ERK1/2激活,将大鼠随机分为溶剂二甲基亚砜对照组(DMSO group)、U0126组(U0126 group)、叶酸高剂量组(HFA group)、叶酸高剂量+U0126组(HFA+U0126 group)四组,U0126组为造模前30min尾静脉注射ERK通路特异性阻滞剂U0126,western blot方法检测各组造模24h后脑组织中pERK1/2蛋白表达情况。结果与SO组比较,MCAO组大鼠神经功能评分、学习次数、脑梗死体积百分比明显增加(P<0.05),记忆正确率降低(P<0.05);而补充叶酸组大鼠神经功能评分、学习次数、脑梗死体积百分比均低于MCAO组(P<0.05),记忆正确率高于MCAO组(P<0.05)。脑缺血可导致血清叶酸含量降低(P<0.05),血浆Hcy水平升高(P<0.05),神经细胞凋亡率增加(P<0.05),血清中MDA含量升高(P<0.05),SOD、GSH-Px活性水平降低(P<0.05);补充叶酸能明显提高血清叶酸水平(P<0.05),降低血浆Hcy水平(P<0.05),减少神经细胞凋亡率及血清中MDA含量(P<0.05),提高SOD、GSH-Px活性水平(P<0.05)。局灶性脑缺血损伤可诱导pERK1/2蛋白的表达,造模后1～7d表达水平升高,3d为表达高峰,第14d恢复至基线水平;局灶性脑缺血后3d、7d,补充叶酸能上调pERK1/2蛋白表达(P<0.05),14d时叶酸对pERK1/2蛋白表达已无影响。免疫荧光染色结果显示,ERK1/2免疫阳性细胞分布广泛,在各个脑区均可见,pERK1/2免疫阳性细胞多见于脑组织皮质区,其次为海马区。各组总ERK1/2蛋白荧光强度差异无统计学意义(P>0.05),各组pERK1/2蛋白荧光强度比较结果同缺血后7d western blot检测结果一致。注射U0126可明显降低脑缺血后pERK1/2蛋白表达水平(P<0.05),并可显著降低脑缺血时高剂量叶酸诱导的pERK1/2蛋白表达水平(P<0.05),说明ERK信号通路参与了叶酸诱导的ERK1/2活化过程。结论叶酸能减少脑缺血大鼠神经功能缺损症状、提高学习记忆能力及减小脑梗死体积,对局灶性脑缺血损伤具有一定的保护作用。叶酸对脑缺血损伤的保护作用机制可能与叶酸能降低血浆Hcy水平,拮抗自由基氧化损伤,抑制神经细胞凋亡,或上调ERK信号通路中pERK1/2蛋白表达有关。