目的:1.构建人CD44基因变异体(CD44 variant,CD44v)真核表达载体(pcDNA3.1-CD44v),并将其稳定转染入人乳腺癌细胞株(MCF-7)中,为深入研究CD44v基因的功能奠定基础。2.将人乳腺癌多药耐药细胞株(MCF-7/Adr)中新发现的CD44v(Gene Bank No.FJ216964)转染入MCF-7细胞株中,观察MMP-2、MMP-9表达水平的变化,分析CD44v与MMP-2、MMP-9表达的关系,研究CD44v对MCF-7细胞株侵袭能力的影响,探讨CD44v调节MMP-2、MMP-9表达的胞内信号转导机制。3.观察转染pcDNA3.1-CD44v前后,MCF-7细胞株增殖方面的差异。方法:1.采用RT-PCR及流式细胞术,鉴定MCF-7及MCF-7/Adr细胞株中CD44基因及蛋白的表达。2.从MCF-7/Adr细胞中提取总RNA进行RT-PCR,获得全长cDNA模板,使用含有限制性内切酶Kpn I和EcoRI酶切位点引物进行PCR反应,从而获得带有酶切位点CD44基因产物,PCR产物于1%琼脂糖凝胶电泳后切胶回收,并参照胶回收试剂盒说明书对PCR产物进行回收,纯化。3.将PCR纯化产物连接于pMD19-Tsimple vector上,TA克隆后,提取质粒并测定含量及进行双酶切反应验证,将含阳性质粒转化菌进行DNA测序。4.Kpn I和EcoR I分别双酶切真核表达载体pcDNA3.1和CD44TA克隆质粒,T4连接酶定向连接,大肠杆菌扩增,小提质粒后酶切鉴定,阳性质粒进行测序验证。5.脂质体法将pcDNA3.1-CD44v质粒转染到MCF-7细胞中,48小时后RT-PCR和流式细胞术检测转染前后CD44基因、蛋白在MCF-7细胞中的表达变化。6.透明质酸(hyaluronan,HA)处理细胞24小时后,收集各实验组细胞进行RT-PCR检测,检测各组细胞CD44v,MMP-2及MMP-9 mRNA表达情况,并收集细胞培养上清,离心后进行明胶酶谱法分析MMP-2、MMP-9蛋白活性,从而了解CD44v对MMP-2、MMP-9表达水平的影响。7.Transwell检测各实验组细胞侵袭力变化情况。8.western blotting检测erk及磷酸化erk(p-erk)变化,从而探讨CD44v调节MMP-2及MMP-9表达的胞内信号转导机制。9.显微计数法及流式细胞术检测CD44v对MCF-7/CD44v细胞增殖能力的影响。结果:1.CD44基因在多药耐药MCF-7/Adr细胞中高表达,而在亲代敏感细胞株MCF-7中不表达。2.将该CD44基因克隆入pMD19-T载体中,经TA克隆后进行测序验证,结果显示:该CD44v包含CD44基因1-4号外显子、16-17号外显子、18号外显子1-205位硷基;将该基因序列登录NCBI,基因登录号FJ216964。3.将CD44v成功克隆入pcDNA3.1质粒中,产生重组质粒pcDNA3.1-CD44v,并通过酶切及DNA测序验证。4.转染重组质粒pcDNA3.1-CD44v 48小时后,通过RT-PCR方法,在MCF-7中检测到CD44基因mRNA表达明显上调,流式细胞术检测发现CD44蛋白表达水平上调,表达率为(70.0±2.5)%;将上述表达CD44基因及蛋白的瞬时转染MCF-7细胞经G418筛选后获得阳性克隆。5.转染重组质粒载体pcDNA3.1-CD44v并用透明质酸处理作用24小时后,MCF-7细胞株中MMP-2、MMP-9 mRNA表达明显上调,相应蛋白活性与mRNA水平呈现一致性改变,细胞侵袭力明显上调(P<0.05);透明质酸(HA)→CD44通过ras信号依赖性的方式调节MMP-2、MMP-9表达及转染细胞(MCF-7/CD44v)侵袭力。6.中和性CD44单抗预处理MCF-7/CD44v细胞后,显著阻断了MMP-2,MMP-9分泌及MCF-7/CD44v细胞侵袭力。7.CD44v可以使MCF-7/CD44v细胞增殖能力下降。结论:1.在MCF-7/Adr中新发现一种CD44v(Gene BankNO.FJ216964),成功克隆和建立人CD44v真核表达质粒载体(pcDNA3.1-CD44v),将该质粒载体导入MCF-7细胞后,CD44v表达明显上调,这为进一步研究其功能打下了基础。2.在MCF-7细胞中,CD44v可以通过上调MMP-2、MMP-9表达水平,从而增加肿瘤细胞的侵袭能力。3.透明质酸可能与CD44受体相结合,通过CD44→ras→MAPK信号传导通路调节MMP-2、MMP-9产生,从而增加肿瘤细胞的侵袭能力。4.中和性CD44单抗预处理MCF-7/CD44v细胞后,可以显著阻断MMP-2、MMP-9分泌,降低MCF-7/CD44v细胞侵袭力。5.CD44v过表达可以抑制MCF-7/CD44v细胞增殖能力。