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L-蛋氨酸是人体八种必需氨基酸之一，在动物饲料中是第一限制性氨基酸，市场需求量极大。由于化学合成法生产成本较高且环境污染大，研究者们对发酵法生产蛋氨酸做了大量尝试。本研究以大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)为出发菌株，通过敲除代谢阻遏基因和紫外诱变育种解除蛋氨酸反馈阻遏的方法，获得了高产L-蛋氨酸的工程菌株；通过过量表达关键基因进一步提高蛋氨酸产量；在此基础上对该菌株进行了摇瓶水平上的培养基组分优化和发酵条件优化。具体研究内容以及实验结果如下：通过Red同源重组敲除其metJ基因，获得了解除metJ阻遏子阻遏的E. coliBL21(DE3) ΔmetJ菌株，经检测其L-蛋氨酸生产能力由不产蛋氨酸提升至产蛋氨酸22mg·L-1。以E. coli BL21(DE3) ΔmetJ为出发菌株，通过紫外诱变筛选抗DL-乙硫氨酸(蛋氨酸结构类似物)突变株，对突变株经过筛选获得了L-蛋氨酸产量为61mg·L-1的高产菌株(YB12)，与出发菌株相比，其蛋氨酸积累量提高了2倍。YB12在连续七次传代培养中蛋氨酸产量保持稳定。以具有双T7启动子的质粒pACYCDuet-1为骨架，构建了表达质粒pACYCDuet-AES用于在YB12中强化表达metA基因、 cysE基因和yeaS基因。经检测，YB12/pACYCDuet-AES菌株L-蛋氨酸产量得到进一步提高，达到182mg·L-1，是YB12产量的3倍。运用单因素实验和响应面分析的方法对YB12/pACYCDuet-AES的发酵培养基组分进行优化，确定发酵培养基最佳组分。通过单因素实验对摇瓶发酵培养条件进行优化，得到最佳培养条件为：250mL摇瓶装液量15mL、培养基初始pH为7.0、接种量10%、异丙基硫代-β-D-半乳糖(IPTG)浓度0.1mmol·L-1、发酵温度37℃。在此发酵条件下发酵48h，L-蛋氨酸积累量最终达到395mg·L-1。