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鸡球虫病(Coccidiosis)是由艾美耳科,艾美耳属(Eimeria)的一种或几种鸡艾美耳球虫引起的以肠道感染为主的细胞内原虫病,鸡球虫寄生于各段肠道引起发病,导致腹泻、便血和体重降低,对养禽业造成严重的经济损失。目前对鸡球虫病的防治主要以药物为主,但由于容易出现耐药性及药物残留,使得一些药物难以发挥其有效的作用。目前,安全而有效的基因工程疫苗用于鸡球虫病的防治已成为研究热点。基因工程疫苗候选基因的选择至关重要,Hsp90家族是分子大小质量81~99 Ku的一种进化保守的蛋白质,在分子伴侣功能、细胞循环调控、抗原传递方面发挥着重要作用,已有研究表明其与多种寄生虫生长发育过程关系密切。本研究根据已经发表的堆型艾美耳球虫(E.acervulina)Hsp90基因序列设计一对特异性引物,通过RT-PCR方法从E.acervulina子孢子中成功克隆得到大小为2 433 bp的Hsp90基因序列,其中包含一段大小为2 139 bp的开放性阅读框,编码713个氨基酸残基,蛋白分子质量大小为82.5 Ku,将ORF通过多克隆位点插入p ET-30a(+)空载体中,成功构建了重组表达质粒p ET30a-Hsp90,转化入E.coli Rosetta感受态细胞并经IPTG诱导,通过SDS-PAGE及His单抗Western-blot检测,结果显示一个大小为89 Ku的可溶性融合蛋白得以高效表达。以纯化的Hsp90蛋白免疫新西兰大白兔制备兔抗Hsp90多克隆抗体,间接ELISA和Western-blot检测表明其反应性和特异性良好。通过利用一段抗原性小的柔性片段(G4S)3多肽linker,将Hsp90与Ch IL-18基因连接后构建p VAX-Hsp90及p VAX-IL18-Hsp90重组真核表达质粒,体外瞬时转染BHK21细胞进行IFA检测,结果显示Hsp90及IL-18均可在体外成功表达,可较好的发挥其免疫原性并用于后续动物免疫保护实验。实验鸡分为5组,分别为未免疫未攻虫组(N组)、PBS注射攻虫组(P组)、p VAX1质粒注射组(E组)、p VAX-Hsp90质粒免疫组(H组)、p VAX-IL18-Hsp90质粒免疫组(I组)。实验组分别以100μL/鸡的PBS或100μg/鸡的p VAX1、p VAX-Hsp90或p VAX-IL18-Hsp90剂量于14 d和21 d胸部肌肉注射免疫雏鸡,在二次免疫后每只鸡口服接种1×105个孢子化卵囊。检测不同处理组雏鸡淋巴细胞增殖功能变化、血清抗体Ig G变化、增重情况、十二指肠病变计分、OPG及抗球虫指数等各项指标,用以评价真核表达质粒的免疫保护效果,结果表明两个实验组各项指标均优于对照组,且I组数值均高于H组;H组与I组的淋巴细胞增殖活性在免疫后显著升高;ELISA方法检测血清抗体Ig G显示,H组与I组抗Hsp90血清抗体效价两次免疫持续升高,且在35日龄时达到最高值,而对照组未见升高;H组与I组综合抗球虫指数值分别为166.17和175.32,均可产生有效的抗球虫保护,这表明Hsp90是一种潜在的球虫保护性抗原,且Ch IL-18对其免疫效果起到佐剂样的作用,本研究为Hsp90的深入研究及鸡球虫病的免疫防治提供了理论和实验基础。