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胃癌(gastric carcinoma)是来源于胃黏膜上皮的一种肿瘤,作为全球性常见的恶性肿瘤,在所有癌症中死亡率居第三位,胃癌是一种多因素造成的的综合性疾病,认为环境因素和遗传因素都会致癌。胃癌可分为早期胃癌和晚期胃癌,近年来有研究表明手术切除治疗、放射治疗和分子靶向治疗是主要的治疗方法,但预后仍然还是很差,5年生存率较低,因此探索胃癌的复杂发病机制是迫待解决的。组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)是一类蛋白酶,组蛋白乙酰化在染色质重塑和基因表达调控等方面起着重要作用。组蛋白乙酰化激活基因的表达。而去乙酰化组蛋白则抑制特定基因的表达,尤其是一些肿瘤抑制基因的表达。HDAC3是HDAC家族成员,目前的研究表明HDAC3在肝癌、结直肠癌和神经母细胞瘤等多种癌症中有重要作用。但是,HDAC3基因在胃癌中研究少有报道,尤其是HDAC3与脂代谢在胃癌中的相互作用的报道更少。因此本课题研究了HDAC3对胃癌细胞增殖、迁移和脂代谢的影响及其对胃癌细胞调控机制的进一步的探究,希望能为胃癌的治疗提供新思路和一定的理论依据。本研究的主要研究结果如下:1.组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA对胃癌增殖的影响本研究通过查阅文献以及MTT实验,确定了HDAC抑制剂TrichostatinA(TSA)处理MKN-45和SGC-7901细胞的适宜浓度和处理时间。随后用适宜的浓度处理MKN-45和SGC-7901细胞,运用MTT、BrdU实验检测,结果发现随着TSA浓度的增高显著抑制MKN-45和SGC-7901细胞数量和BrdU阳性率。接着通过流式细胞分析,发现TSA处理后,MKN-45和SGC-7901细胞阻滞在G0/G1期的数量明显多于对照组,Western blotting实验检测G0/G1期相关蛋白的下调,进一步证实了该结果。接着细胞流式实验检测细胞凋亡,发现TSA诱导凋亡细胞数量显著增多,Western blotting实验也证实了TSA诱导胃癌细胞凋亡。为了进一步确定TSA对胃癌细胞的增殖抑制能力,进行了软琼脂实验,结果显示TSA显著抑制了SGC-7901和MKN-45细胞的体外克隆形成能力。为了进一步探究TSA抑制胃癌细胞的增殖和凋亡的具体分子机制,本研究通过Western blotting实验检测与细胞增殖、凋亡密切相关的PI3K/AKT通路的关键蛋白,结果显示TSA增强了H3的乙酰化并抑制了PI3K/AKT的激活。以上结果说明,TSA通过抑制PI3K/Akt通路而抑制胃癌细胞的增殖能力和诱导凋亡。2.组蛋白去乙酰化酶HDAC3对胃癌增殖、转移及成瘤能力的影响基于组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA对胃癌增殖、凋亡的作用,本研究通过阅读文献:当HDAC3下调和TSA处理都可以显著增加细胞中肝脏脂质代谢的重要调节剂FGF21的表达上调;TSA处理会降低HDAC3的表达,增加了KAT2A的表达来提高牛SCNT胚胎的体外发育能力;TSA通过HDAC3增加肺小细胞癌Dleu2/miR-15a/16-1的表达而抑制细胞增殖;通过这些文献发现TSA在肿瘤中的作用与组蛋白去乙酰化酶HDAC3密切相关,于是本研究对HDAC3在胃癌中的作用进行了学习和探究。本研究分析TCGA胃癌病人预后数据库,发现HDAC3与胃癌病人的预后呈负相关。接着用慢病毒介导的shRNA干涉技术下调HDAC3的表达,并通过qRT-PCR和Western blot实验检测HDAC3的干涉效率,然后通过MTT、BrdU实验发现下调HDAC3的表达后显著抑制胃癌细胞系MKN-45和SGC-7901的增殖;接下来检测HDAC3对胃癌细胞周期的影响,发现下调HDAC3的表达后细胞周期阻滞在G0/G1期;恢复HDAC3的表达后消除细胞的周期阻滞。Transwell实验结果表明下调HDAC3的表达抑制了胃癌细胞的迁移侵袭能力,同时Western blotting检测与迁移侵袭相关蛋白的表达量的下调证实了这一结果。恢复HDAC3的表达后胃癌细胞抑制的增殖迁移和侵袭能力得到了恢复。通过体外软琼脂克隆实验结果发现下调HDAC3表达后抑制了胃癌细胞的体外克隆形成能力,而恢复HDAC3的表达后实验结果得到了恢复。接着通过裸鼠皮下成瘤实验,结果表明下调HDAC3表达量明显降低了细胞的体内成瘤能力,最后对小鼠中的肿瘤组织进行了H&E染色和免疫组化实验,发现下调HDAC3后的细胞数量和细胞核明显比对照组小,并且在实验组HDAC3和Ki67的表达也明显少于对照组。PI3K/AKT是人类肿瘤中常见与肿瘤发生发展相关的重要信号通路,本研究用Western blotting检测PI3K/AKT,发现下调HDAC3的表达使PI3K/AKT通路关键蛋白表达量明显下调,同时恢复HDAC3的表达后PI3K/AKT通路的相关蛋白的表达量明显上调。以上实验结果说明抑制HDAC3能通过抑制PI3K/AKT通路来抑制胃癌细胞增殖、迁移侵袭和体内体外成瘤能力。3.组蛋白去乙酰化酶HDAC3调控胃癌脂代谢和ROS影响细胞凋亡脂质在体内有多种重要的生物功能,伴随着有多条复杂的代谢通路,脂质代谢异常可能会引发多种人类疾病的,近年来有研究表明脂代谢异常可能是癌症发生发展的一个关键诱因。本研究探讨了HDAC3对胃癌脂代谢的影响。本研究首先检测在MKN-45和SGC-7901细胞中下调HDAC3后对细胞中脂肪酸和胆固醇通路的影响,发现脂肪酸和胆固醇通路的关键基因的mRNA和蛋白水平均有明显上调。而恢复HDAC3的表达也恢复了这些基因的m RNA和蛋白水平。于是,本研究用胆固醇检测试剂发现下调HDAC3的MKN-45和SGC-7901细胞中胆固醇含量显著增加了。以上结果说明HDAC3参与了细胞的脂肪酸和胆固醇的代谢。胆固醇和脂肪酸是许多生物过程中涉及的必需脂质,但是过多的脂质会导致活性氧(ROS)的产生,进一步引诱脂毒性导致细胞死亡。活性氧(ROS)检测实验发现,下调HDAC3的表达后,胃癌细胞中的活性氧(ROS)被激活大量产生;接着通过qRT-PCR发现氧化应激中几个抗氧化基因的mRNA水平明显被激活上调;基于氧化应激的发生,本研究检测了细胞凋亡,发现下调HDAC3后的胃癌细胞凋亡数量显著增多,而且通过Western blotting检测凋亡蛋白表达进一步验证。本研究对HDAC3调控脂代谢的分子机制进行研究,最后通过免疫共沉淀实验发现HDAC3可以与胆固醇合成的关键调控因子SREBP2和胆固醇合成限速酶HMGCR相互作用。以上结果说明,下调HDAC3会激活胃癌细胞的胆固醇合成,胆固醇以及游离胆固醇含量显著增加并诱导ROS大量生成,ROS诱导氧化应激和细胞凋亡。综上,下调HDAC3不仅会抑制胃癌细胞的增殖和迁移侵袭而且上调胆固醇合成通路导致脂代谢异常引起脂毒性来诱导胃癌细胞凋亡。