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目的通过原代培养的大鼠海马神经元,运用Toll样受体4(toll-like receptor 4,TLR4)的天然配体脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)或其他不同的工具药,以激活或阻断TLR4的作用,探讨海马神经元中是否存在TLR4介导的PTEN/PI3K/AKT/NF-κB信号通路以及该信号通路的激活在神经炎症中的作用。揭示海马神经元中存在TLR4介导的PTEN/PI3K/AKT/NF-κB信号通路以及该信号通路的激活参与了神经炎症反应。为海马神经元TLR4介导的信号通路在神经炎症中的作用提供了更多的实验依据。方法采用原代培养7 d的新生大鼠海马神经元,细胞免疫荧光双标法鉴定海马神经元的纯度。应用TLR4的配体LPS、TLR4抗体或其他工具药预处理海马神经元,以激活或阻断TLR4信号通路的作用。用Western Blot检测PTEN、AKT及其磷酸化水平;细胞免疫荧光双标法观察海马神经元中核因子κB/P65(nuclear factor-κB/P65,NF-κB/P65)核易位情况;酶联免疫吸附试验技术(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测海马神经元培养上清中的炎症因子肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factors alpha,TNF-α)和白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)的含量,实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)方法检测海马神经元中TNF-α、IL-1βmRNA的水平。结果新生1 d的SD大鼠海马神经元培养7 d后,其纯度可达到95%以上。AKT蛋白在不同浓度的LPS刺激不同时间后表达无明显变化,而PTEN蛋白在不同浓度的LPS刺激8 h后无明显变化,24 h后随LPS浓度的增加表达量减少,48 h后随LPS浓度的增加表达增加,并且当LPS的浓度为1μg/ml时其减少或增加的水平最为明显(P<0.01,P<0.05)。采用浓度为1μg/ml的LPS刺激海马神经元不同时间后,AKT mRNA表达不变,但PTEN mRNA在LPS刺激12 h后开始增加(P<0.01,P<0.05);在LPS刺激早期对PTEN和AKT的蛋白表达无显著影响,而能够降低PTEN的磷酸化水平和轻度增高AKT的磷酸化水平(P<0.01,P<0.05);同时LPS能够促进NF-κB/P65由细胞浆向细胞核内转移,增加TNF-α、IL-1βmRNA的表达,提高细胞培养上清中TNF-α和IL-1β的水平;而用TLR4抗体阻断后,使PTEN的磷酸化水平增加,AKT的磷酸化水平相对降低(P<0.01,P<0.05);用PTEN抑制剂bpV(pic)预处理后,可上调PTEN和AKT的磷酸化水平(P<0.01,P<0.05);用TLR4抗体、bpV(pic)和NF-κB拮抗剂(PDTC)分别预处理后,能减弱LPS对大鼠海马神经元NF-κB/P65的核易位作用,同时可下调LPS引起的TNF-α和IL-1β的mRNA的表达和培养上清中这两种炎症因子的水平(P<0.01,P<0.05)。结论1.在LPS刺激引起的炎症反应早期,海马神经元AKT、PTEN基因和蛋白表达均无明显变化。在炎症反应中、晚期,AKT的基因和蛋白均无明显变化,而PTEN的蛋白表达在炎症中期减少,反馈性的引起基因表达增加,随着LPS浓度的增加和刺激时间的延长,其基因和蛋白表达均增加。2.LPS刺激海马神经元早期,AKT和PTEN均是通过其磷酸化或去磷酸化形式发挥作用,而TLR4抗体和PTEN抑制剂均可减弱由LPS刺激引起的AKT和PTEN的活性的增加。3.LPS可诱导海马神经元核转录因子-κB(NF-κB/p65)的核易位,进而促进炎症因子TNF-α和IL-1β的释放;而TLR4抗体、PTEN抑制剂bpV(pic)和NF-κB拮抗剂PDTC预处理细胞后均可下调LPS引起的NF-κB/p65的核易位作用以及降低TNF-α和IL-1β的表达。4.以上结果提示:海马神经元中存在TLR4介导的PTEN/PI3K/AKT/NF-κB信号通路,该信号通路的激活可上调TNF-α和IL-1β的表达。海马神经元中TLR4/PTEN/PI3K/AKT/NF-κB信号通路参与了神经炎症反应,神经元不是神经炎症反应中的被动者。