骨髓腔内含有造血和基质两大细胞组织系统。前者由造血干细胞及其分化的造血细胞组成,后者是一个异质细胞群体,包括成纤维细胞、网状细胞、脂肪细胞、巨噬细胞及内皮细胞等,其中含有多能干细胞(multi-potential stem cell),亦称为骨髓基质干细胞(bone marrow stromal stem cell, BMSC)。又由于其来源于中胚层的间充质,系胚胎发育过程中少量原始间充质细胞迁移填充组织间隙时定居骨髓腔而来,并且可在特定情况下分化为间充质来源的各种组织以修复缺损,所以又被称为骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)。1986年,Friedenstein等最早证实了骨髓间充质干细胞的存在。骨髓间充质干细胞是一类可进行自我复制和更新的细胞,在不同的理化环境和细胞因子的诱导下能够跨胚层向骨、软骨、脂肪、神经、肌肉等多种谱系分化。骨髓间充质干细胞的主要优点有：1、易于从自身取材,无免疫排斥反应之忧,因而也就更易为病人所接受；2、成体干细胞,涉及较少伦理问题；3、体外易于扩增。易分离、扩增以及体外操作简便。基于骨髓间充质干细胞的以上优点,其在组织器官缺损性疾病,组织器官退行性疾病,遗传缺陷性疾病等方面都有重要的应用前景。类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种慢性、自身免疫性、炎症性关节病。表现为对称性多关节炎性病变,可侵犯多个大、小关节,并伴有晨僵,乏力,体重减轻及全身多器官、多系统受累。其病理特征为滑膜血管的增生与炎性细胞的浸润,后者进一步导致滑膜、软骨乃至软骨下骨组织的受损,最后引起关节破坏。类风湿性关节炎的发病机制尚未完全明确,因而还缺乏特异性治疗措施。目前临床上的治疗方法有：1、非药物性物理疗法2、药物治疗3、自体造血干细胞移植(HSCT)4、基因治疗5、外科手术治疗等。然而,现有的治疗方法主要是控制症状,延缓病情的发展,调节机体的免疫应答反映。但是对于已经发生的关节内软骨及骨损伤,仍然没有很明显的疗效,寻找和探讨新的有效治疗方法,成为医学工作者的义不容辞的责任。随着骨髓间充质干细胞研究的深入发展,采用干细胞治疗某些疑难病症的研究探讨临床上已经有诸多报道,但采用骨髓间充质干细胞治疗类风湿性关节炎的研究尚属少见,本研究将为类风湿性关节炎的治疗开辟了一个新的途径。骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins, BMPs)属于转化生长因子-β(transforming growth factor B, TGF-β超家族的成员,1965年Urist等人首先从脱钙骨基质提取物中分离得到的一种具有活性的蛋白质,这种蛋白具有使未分化的间充质细胞定向分化为成骨细胞,并进而可合成胶原性蛋白,形成钙化的骨组织能力,因此命名为骨形态发生蛋白。在体(in vivo)和离体(invitro)实验表明BMPs具有调节成骨细胞和成软骨细胞的分化,诱导异位骨形成,促进骨折愈合,及其具有控制哺乳动物骨骼不同形态特征形成的功能。随着研究的深入,研究者发现BMPs的生物学作用不仅限于骨的发育和形成,而且几乎涉及全身所有系统,包括心血管、胃肠、呼吸、泌尿生殖、体被及神经系统的胚胎发育、生长和分化。目前,已确认的BMPs家族成员达40多个。BMP-6最初是从鼠胎盘cDNA文库中分离得到的,并根据其与爪蟾属相类似,被命名为生长相关苍白基因(Vgr-1)。1990年Celeste等从人的胎盘及胎脑cDNA文库中分别克隆到Vgr-1的同源基因,根据它与BMP家族的同源性而定名为hBMP-6。研究表明,BMP-6能启动软骨细胞成熟,诱导间充质细胞向成软骨细胞方向分化,是软骨细胞分化的一个自分泌刺激因子。目前关于BMP-6诱导或是作为目的基因整合入MSCs诱导其分化的研究国内外仍然较少。基于以上研究背景,我们拟建立类风湿性关节炎的大鼠模型,体外分离培养扩增骨髓间充质干细胞,利用腺病毒载体,介导hBMP-6基因转染MSCs,并注入模型关节内,诱导达到抗炎及软骨修复的双重治疗效果。目的构建携带hBMP-6目的基因的腺病毒载体；转染骨髓间充质干细胞,使其在关节炎模型大鼠体内分化为软骨细胞并分泌目的基因蛋白,为骨髓间充质干细胞临床治疗类风湿性关节炎提供新的思路和实验依据。方法1.骨髓间充质干细胞的分离、培养、鉴定：取幼年Wistar大鼠股骨和胫骨髓腔内细胞,用贴壁培养法分离骨髓基质干细胞,培养、传代并纯化。细胞纯化后,用流式细胞仪检测干细胞表面抗原CD14,CD20,CD34和CD90的表达,其中CD29和CD90呈阳性,CD14和CD34呈阴性,即所测细胞为MSC。2.Ad-hBMP-6腺病毒载体的构建与骨髓间充质干细胞转染的实验研究：本部分实验涉及的试剂诸多,方法也比较复杂,技术层面广,难度大。首先要做的是腺病毒质粒pDc.菌种的复活、活化,形成感受态后再酶切、鉴定,保存等系列过程；还要应用12-15传代HEK293细胞复活、孵化,脂质体质粒转染、除毒等程序,获得第一代毒种,参与下一步实验；应用酶切、转化等手段达到构建携带hBMP-6穿梭质粒pDC316的目的；尔后参与腺病毒hBMP-6载体的构建与重组；重组的腺病毒hBMP-6蛋白经过免疫组化、ELASA法检测后,在扩增、浓缩、重组,经病毒滴定检测,滴度为7.94×1010IU/ml,达到复合应用的标准,最终证实我们成功地构建了含BMP-6基因的Ad-hBMP-6腺病毒载体,为第三步的研究工作提供了有效的分子水平上的工具。3.转染后的骨髓间充质干细胞对类风湿性关节炎模型大鼠的治疗研究：实验选取16只雄性Wistar大鼠建模,加强免疫14d后,应用关节炎指数(arthritis index, AI)评定法评分,AI评分>2的为建模成功。实验过程中,要观察大鼠生活状态,体重变化,模型关节红肿程度等。MSCs治疗组与对照组相比情况,准确详细的记录测得数据,整理后进行统计学处理。并在MCSs移植后的不同时段,取后踝关节脱钙,石蜡包埋切片,行免疫组化染色,移植腺病毒转染后的骨髓间充质干细胞至CIA模型组大鼠损伤的关节滑膜,评价治疗作用。结果1.成功的从大鼠骨髓中分离出骨髓间充质干细胞,将其培养、传代、鉴定,证实为骨髓间充质干细胞。在一定条件下进行诱导分化,使其成为具有向软骨成骨细胞分化潜能的干细胞。2.用腺病毒AdMaxTM包装系统,成功构建了携带BMP-6基因的重组腺病毒hBMP-6载体,经酶切和序列分析证实重组质粒构建正确,无缺失,然后经插入、移码等程序均符合要求。并用PCR、免疫组化和ELISA等多种先进技术方法,证实hBMP-6基因的Ad-hBMP-6腺病毒载体构建成功。3.成功构建携带目的基因BMP-6的腺病毒载体,并成功转染骨髓间充质干细胞。4.转染后的骨髓间充质干细胞用于治疗类风湿性关节炎的模型大鼠,取得了预期的结果。结论1.实验中成功的分离出骨髓间充质干细胞,培养、传代、鉴定证实为骨髓间充质干细胞,并将其诱导为具有向成软骨细胞分化潜能的干细胞。2.成功地采用腺病毒AdMaxTM,构建了携带hBMP-6基因的重组腺病毒,通过酶切、序列分析等手段重组了腺病毒Ad-hBMP-6,经检测构建正确,无缺失、经过插入、移码等程序表明均符合要求,并用PCR、免疫组化和ELISA先进技术方法,证实含hBMP-6基因的Ad-hBMP-6腺病毒载体构建成功。3.携带目的基因hBMP-6的腺病毒载体,转染入骨髓间充质干细胞,经体外实验表明此干细胞可分化为成软骨细胞。4.目的基因hBMP-6的腺病毒载体转染后的骨髓间充质干细胞,被用于治疗类风湿性关节炎的模型大鼠,获得了良好的治疗效果。5.本研究为骨髓间充质干细胞临床治疗类风湿性关节炎提供了实验依据资料。6.实验结果表明本实验设计方案正确、技术路线合理,采用方法先进,达到了预期的实验研究目的。创新性1.首次成功地应用腺病毒AdMaxTM包装系统,构建携带hBMP-6基因的重组腺病毒载体,并转染大鼠骨髓间充质干细胞,生成携带目的基因hBMP-6的骨髓间充质干细胞。2.首次应用hBMP-6基因修饰的大鼠骨髓间充质干细胞治疗胶原介导的类风湿性关节炎大鼠模型,并取得有意义的疗效,为骨髓间充质干细胞治疗类风湿性关节炎的研究开辟了新的思路与途径。3.本研究在实验过程中应用了淋巴学、细胞分子生物学、病毒学、免疫学研究的多种先进技术方法,涉及的技术层面广、难度大,不少研究过程是借用常规方法无法完成预期目的,不少方法步骤需要改变路径、剂量、时间等才能获得结果,例如,穿梭质粒pDC316-hBMP-6的构建,重组腺病毒对大鼠骨髓间充质干细胞感染效率的测定等。这些技术的改进与方法上的变革,实际上许多方面是研究技术、方法上的创新,也从中吃了很多苦头,使得本人本是5年的硕博连读,延长到7年,从中磨练了自己的科研毅力和意志,也获的了宝贵的经验与教训。