论文部分内容阅读
目的:巨噬细胞是机体固有免疫反应系统中的重要组成成分之一,而细胞自噬可能会影响巨噬细胞的正常吞噬功能和细胞因子分泌。本研究以J774A.1小鼠巨噬细胞为研究对象,通过体外亚砷酸钠染毒,观察和探究无机砷对巨噬细胞自噬—溶酶体途径及其上游调控因子TFEB的可能影响。研究方法:1、采用MTS法测定不同浓度无机砷暴露时J774A.1巨噬细胞的增殖活力。2、Western blot免疫印迹法检测无机砷处理组LC3、p62、LAMP1、LAMP2、Cathepsin B、Cathepsin D、Cathepsin S、Cathepsin L和TFEB的蛋白表达水平。3、J774A.1巨噬细胞进行TFEB免疫荧光染色。4、Real-time PCR法分析Cd80、Cd86、Map1lc3a/b、p62、Lamp1、Lamp2和Tfeb mRNA的表达水平。应用SPSS17.0软件进行数据的统计分析。结果:1、低浓度0.25μM As~Ⅲ对J774A.1巨噬细胞有轻微促增殖作用,0.5-2μM As~Ⅲ对细胞增殖活力无毒性效应,2.5-10μM As~Ⅲ明显降低细胞的增殖能力(P<0.05)。2、LPS刺激巨噬细胞后,细胞伪足明显增加。经2μM As~Ⅲ处理后细胞变圆、伪足减少,且伴有粘附力降低。As~Ⅲ+LPS处理组同单纯LPS刺激组相比,表现更明显。3、2μM As~Ⅲ处理后,巨噬细胞Cd80和Cd86 mRNA的表达水平降低。4、Western blot检测发现,不同浓度无机砷处理后均可引起LC3的表达量增高(P<0.05)。0.5μM As~Ⅲ分别染毒6 h、12 h、24 h的不同染毒时间LC3蛋白表达量均显著增高。2μM As~Ⅲ可促进Map1lc3a/b mRNA的表达。5、不同浓度无机砷处理后均可引起p62蛋白表达的增高(P<0.05)。0.5μM As~Ⅲ分别处理细胞6 h、12 h、24 h的不同染毒时间p62蛋白表达均明显增高(P<0.05)。2μM As~Ⅲ可促进p62 mRNA的表达(P<0.05)。6、无机砷暴露可在一定程度上促进J774A.1巨噬细胞中溶酶体相关膜蛋白LAMP1/2的蛋白及其mRNA表达(P<0.05);不同浓度无机砷处理可一定程度促进CTSB/S/L的蛋白表达(P<0.05)。7、As~Ⅲ+LPS共同处理巨噬细胞,可剂量依赖性增加TFEB全蛋白和核蛋白表达(P<0.05)、以及TFEB的核转位,而TFEB胞浆蛋白表达无明显变化。2μM As~Ⅲ处理巨噬细胞后Tfeb mRNA表达增多(P<0.05)。结论:1、无机砷抑制巨噬细胞协同刺激分子CD80和CD86的表达;2、无机砷促进巨噬细胞自噬相关分子LC3和自噬底物蛋白p62/SQSTM1的表达;3、无机砷诱导巨噬细胞溶酶体相关膜蛋白LAMP1/2和组织蛋白酶CTSB/S/L的蛋白表达;4、无机砷明显促进巨噬细胞自噬—溶酶体途径上游转录因子TFEB的表达及其核转位。