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目的：脐带间充质干细胞(hUC-MSC)具有多向分化能力和修复多种组织损伤的潜能，同时也具有肿瘤趋化的特性。hUC-MSC是一群异质性的细胞，是否能筛选出具有更大分化潜能的细胞亚群对于扩大hUC-MSC临床应用潜能具有积极的意义。利用MSC的肿瘤趋化能力，将MSC作为肿瘤治疗中的运输载体，携带促进肿瘤杀伤的相关分子进入肿瘤促进肿瘤杀伤效果，能为开发新的肿瘤治疗方法提供借鉴。本研究旨在探讨通过SSEA4筛选出SSEA4+hUC-MSC的细胞亚群，分析其类全能性；通过在hUC-MSC上表达T细胞共刺激分子，分析其在肿瘤治疗中的作用及机制。从而为hUC-MSC更好的应用于组织损伤修复以及利用hUC-MSC作为运输载体治疗肿瘤提供新的思路。
方法：从新生儿脐带分离出hUC-MSC，通过SSEA4磁珠分选出SSEA4+hUC-MSC。对SSEA4+hUC-MSC细胞进行OCT4等抗体的流式染色，细胞周期分析以及增殖曲线分析。通过RT-PCR和qRT-PCR分析干细胞全能性标志Nanog，OCT4，Sox2和C-myc的表达。将P1和P3代的SSEA4+hUC-MSC在明胶铺被的条件下进行培养，进行类胚体培养实验，14d后对所形成的类胚体进行三胚层细胞标志β-Ⅲ-tubulin、AFP、α-actin和desmin的免疫荧光染色和RT-PCR分析。对hUC-MSC，SSEA4-细胞和SSEA4+细胞进行成骨和成脂诱导实验，并在d0和d14分别对细胞进行成骨细胞和成脂细胞相关标志物的qRT-PCR检测。构建深二度烧伤小鼠皮肤损伤模型，并分别进行hUC-MSC，SSEA4-和SSEA4+hUC-MSC细胞的注射，观察皮肤损伤修复情况。
分别构建鼠源OX40L、鼠源4-1BBL的慢病毒质粒载体，包装慢病毒后分别感染hUC-MSC。hUC-MSC的肿瘤迁移实验采用transwell培养板进行。注射前列腺癌细胞系RM-1分别构建C57小鼠肿瘤模型和裸鼠肿瘤模型。将表达鼠源OX40L、鼠源4-1BBL的hUC-MSC分别注射至C57小鼠模型和裸鼠肿瘤模型中，观察小鼠肿瘤体积大小的变化及小鼠的生存情况。C57小鼠模型MSC注射治疗两周后，分离出肿瘤组织制作石蜡切片，进行CD4/CD8免疫荧光染色。
构建人源OX40L的慢病毒质粒载体，包装病毒后感染hUC-MSC。包装CD19嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor，CAR)慢病毒，感染从脐带血中分离出的T细胞，制备CD19-CART细胞，CD19-CART体外杀伤实验通过流式分析进行。向NOG小鼠注射表达Luciferase的Raji细胞构建白血病小鼠模型。分别将MSC+CART、CART、PBS注射至NOG小鼠模型中，活体成像观察小鼠体内肿瘤的变化情况，以及小鼠的生存情况。小鼠血清IFN-γ，水平通过ELISA方法进行检测。
结果：在hUC-MSC培养过程中，发现了一群高表达SSEA4的形态较小的细胞亚群，其具有比未筛选的hUC-MSC更好的增殖能力，其原始细胞的含量更高。通过免疫荧光检测分析，RT-PCR和qRT-PCR分析显示，SSEA4+细胞集落持续表达干细胞全能性的标志OCT4，Nanog，SOX2，和C-myc，远高于未筛选的hUC-MSC和SSEA4-MSC，其表达量与hESC基本类似，从而初步从全能性标志的表达上证实SSEA4+hUC-MSC具有与胚胎干细胞类似的全能性。SSEA4+hUC-MSC的成脂、成骨诱导分化实验证实了其具有更好的分化能力。SSEA4+hUC-MSC经类胚体诱导培养后，通过免疫荧光能和RT-PCR方法能检测到三胚层的特异性标志β-Ⅲ-tubulin，AFP，α-actin和desmin的高表达，这进一步证实了SSEA4+hUC-MSC的类全能性特征。小鼠烧伤模型修复实验证实了SSEA4+细胞治疗组受损皮肤部位均出现真皮细胞和表皮细胞的大量增加，从而也证实了其皮肤组织修复能力。
将分别感染鼠源OX40L的hUC-MSC(MSC-O)和4-1BBL的hUC-MSC(MSC-4)注射至RM-1造模的前列腺癌C57小鼠模型中后，发现MSC-O和MSC-4均有效的抑制了肿瘤细胞的生长。对治疗后小鼠的肿瘤切片观察后发现治疗组小鼠肿瘤部位的CD4、CD8T细胞出现了显著的增加。而前列腺癌裸鼠模型治疗中，未发现对肿瘤的抑制效果，这初步证实了通过携带T细胞共刺激分子OX40L和4-1BBL的hUC-MSC能够促进肿瘤的杀伤作用，其作用机制是通过招募和激活瘤浸润T细胞来实现的。
本研究还成功制备了胞内信号刺激域为4-1BB的CD19-CART细胞，对CD19阳性的Raji细胞具有良好的体外杀伤效果。通过人源OX40L的基因转染，也制备了表达人源OX40L的hUC-MSC。在构建白血病NOG小鼠模型后，将MSC与CD19-CART联合注射治疗，发现联合治疗组肿瘤控制的效果更为稳定，在d29时基本控制了肿瘤的增殖，NOG小鼠生存率的结果也表明联合治疗组比单纯注射CART组的生存率更高。通过检测治疗后小鼠血清中IFN-γ水平，发现联合治疗组的小鼠血清中人IFN-γ水平更高。从而证实了表达人源OX40L的hUC-MSC能促进了CD19-CART对B细胞肿瘤的杀伤作用。
结论：发现了SSEA4+hUC-MSC具有类全能性特征，有望在组织损伤修复中作为一种新的多能性干细胞来源。利用MSC的肿瘤趋化能力，在hUC-MSC上表达T细胞共刺激分子，证实了其通过刺激T细胞能起到肿瘤杀伤的作用，为利用MSC作为肿瘤治疗中的运输载体，促进肿瘤的治疗效果提供了新的思路。在CART治疗中，利用hUC-MSC作为人工抗原递呈细胞提供T细胞激活的共刺激信号，初步证实了其增强CD19-CART治疗白血病小鼠模型的效果，这也为提高CART在治疗肿瘤尤其是实体瘤的效果提供了全新的策略参考。
方法：从新生儿脐带分离出hUC-MSC，通过SSEA4磁珠分选出SSEA4+hUC-MSC。对SSEA4+hUC-MSC细胞进行OCT4等抗体的流式染色，细胞周期分析以及增殖曲线分析。通过RT-PCR和qRT-PCR分析干细胞全能性标志Nanog，OCT4，Sox2和C-myc的表达。将P1和P3代的SSEA4+hUC-MSC在明胶铺被的条件下进行培养，进行类胚体培养实验，14d后对所形成的类胚体进行三胚层细胞标志β-Ⅲ-tubulin、AFP、α-actin和desmin的免疫荧光染色和RT-PCR分析。对hUC-MSC，SSEA4-细胞和SSEA4+细胞进行成骨和成脂诱导实验，并在d0和d14分别对细胞进行成骨细胞和成脂细胞相关标志物的qRT-PCR检测。构建深二度烧伤小鼠皮肤损伤模型，并分别进行hUC-MSC，SSEA4-和SSEA4+hUC-MSC细胞的注射，观察皮肤损伤修复情况。
分别构建鼠源OX40L、鼠源4-1BBL的慢病毒质粒载体，包装慢病毒后分别感染hUC-MSC。hUC-MSC的肿瘤迁移实验采用transwell培养板进行。注射前列腺癌细胞系RM-1分别构建C57小鼠肿瘤模型和裸鼠肿瘤模型。将表达鼠源OX40L、鼠源4-1BBL的hUC-MSC分别注射至C57小鼠模型和裸鼠肿瘤模型中，观察小鼠肿瘤体积大小的变化及小鼠的生存情况。C57小鼠模型MSC注射治疗两周后，分离出肿瘤组织制作石蜡切片，进行CD4/CD8免疫荧光染色。
构建人源OX40L的慢病毒质粒载体，包装病毒后感染hUC-MSC。包装CD19嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor，CAR)慢病毒，感染从脐带血中分离出的T细胞，制备CD19-CART细胞，CD19-CART体外杀伤实验通过流式分析进行。向NOG小鼠注射表达Luciferase的Raji细胞构建白血病小鼠模型。分别将MSC+CART、CART、PBS注射至NOG小鼠模型中，活体成像观察小鼠体内肿瘤的变化情况，以及小鼠的生存情况。小鼠血清IFN-γ，水平通过ELISA方法进行检测。
结果：在hUC-MSC培养过程中，发现了一群高表达SSEA4的形态较小的细胞亚群，其具有比未筛选的hUC-MSC更好的增殖能力，其原始细胞的含量更高。通过免疫荧光检测分析，RT-PCR和qRT-PCR分析显示，SSEA4+细胞集落持续表达干细胞全能性的标志OCT4，Nanog，SOX2，和C-myc，远高于未筛选的hUC-MSC和SSEA4-MSC，其表达量与hESC基本类似，从而初步从全能性标志的表达上证实SSEA4+hUC-MSC具有与胚胎干细胞类似的全能性。SSEA4+hUC-MSC的成脂、成骨诱导分化实验证实了其具有更好的分化能力。SSEA4+hUC-MSC经类胚体诱导培养后，通过免疫荧光能和RT-PCR方法能检测到三胚层的特异性标志β-Ⅲ-tubulin，AFP，α-actin和desmin的高表达，这进一步证实了SSEA4+hUC-MSC的类全能性特征。小鼠烧伤模型修复实验证实了SSEA4+细胞治疗组受损皮肤部位均出现真皮细胞和表皮细胞的大量增加，从而也证实了其皮肤组织修复能力。
将分别感染鼠源OX40L的hUC-MSC(MSC-O)和4-1BBL的hUC-MSC(MSC-4)注射至RM-1造模的前列腺癌C57小鼠模型中后，发现MSC-O和MSC-4均有效的抑制了肿瘤细胞的生长。对治疗后小鼠的肿瘤切片观察后发现治疗组小鼠肿瘤部位的CD4、CD8T细胞出现了显著的增加。而前列腺癌裸鼠模型治疗中，未发现对肿瘤的抑制效果，这初步证实了通过携带T细胞共刺激分子OX40L和4-1BBL的hUC-MSC能够促进肿瘤的杀伤作用，其作用机制是通过招募和激活瘤浸润T细胞来实现的。
本研究还成功制备了胞内信号刺激域为4-1BB的CD19-CART细胞，对CD19阳性的Raji细胞具有良好的体外杀伤效果。通过人源OX40L的基因转染，也制备了表达人源OX40L的hUC-MSC。在构建白血病NOG小鼠模型后，将MSC与CD19-CART联合注射治疗，发现联合治疗组肿瘤控制的效果更为稳定，在d29时基本控制了肿瘤的增殖，NOG小鼠生存率的结果也表明联合治疗组比单纯注射CART组的生存率更高。通过检测治疗后小鼠血清中IFN-γ水平，发现联合治疗组的小鼠血清中人IFN-γ水平更高。从而证实了表达人源OX40L的hUC-MSC能促进了CD19-CART对B细胞肿瘤的杀伤作用。
结论：发现了SSEA4+hUC-MSC具有类全能性特征，有望在组织损伤修复中作为一种新的多能性干细胞来源。利用MSC的肿瘤趋化能力，在hUC-MSC上表达T细胞共刺激分子，证实了其通过刺激T细胞能起到肿瘤杀伤的作用，为利用MSC作为肿瘤治疗中的运输载体，促进肿瘤的治疗效果提供了新的思路。在CART治疗中，利用hUC-MSC作为人工抗原递呈细胞提供T细胞激活的共刺激信号，初步证实了其增强CD19-CART治疗白血病小鼠模型的效果，这也为提高CART在治疗肿瘤尤其是实体瘤的效果提供了全新的策略参考。