第一部分未成熟脑SC后不同时期海马神经发生和Notch信号途径的动态演变特征目的:探索未成熟脑在惊厥持续状态(Status convulsion,SC)后不同时期海马区神经干细胞(Neural stem cells,NSCs)增殖、迁移、分化的动态演变过程,明确Notch信号途径在SC后不同时期的变化特点。方法:选取20日龄的健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠120只,随机分为SC模型组60只和正常对照组60只。采用氯化锂-匹罗卡品腹腔注射诱导建立SC模型,进行如下实验:(1)用Ki67标记细胞增殖状态,免疫荧光染色检测SC后1d、3d、60d时海马齿状回(dentategyrus,DG)中细胞增殖情况。(2)SC模型建立后腹腔注射Brd U标记NSCs,于SC后7天免疫荧光染色检测Brd U分布情况,分析NSCs的迁移情况。(3)于SC后28天荧光染色双标Brd U和GFAP或双标Brd U和Neu N,以检测NSCs分化为星型胶质细胞和神经元的情况。(4)免疫印迹法检测SC后7d、28d、60d海马Neu N和GFAP蛋白的表达。(5)尼氏染色分析SC后28d海马神经元丢失的情况。(6)Q-PCR检测SC后1d、3d、60d海马Notch1和Hes1m RNA的表达差异。(7)免疫组化染色观察SC后1d、3d、60d Notch1蛋白表达情况和分布。免疫印迹分析SC后1d、3d、60d Notch信号途径相关主要蛋白Notch1、NICD1、Numb1的表达变化。结果:(1)与正常对照组比较,SC后1d海马DG区中Ki67阳性细胞增加(t=6.147,p=0.0003),第3天表达更高(t=6.534,p=0.0002)。而在SC后60天,Ki67阳性细胞的数量迅速减少,甚至低于正常对照组(t=3.158,p=0.0134)。SC组在不同时期Ki67阳性细胞数差异有统计学意义(F=33.21,p<0.0001)。(2)SC后7天,正常对照组大鼠的Brd U阳性细胞多数分布于颗粒细胞下层,少部分开始迁移至颗粒细胞层,在CA1区和CA3区极少有Brd U阳性细胞。而SC组位于齿状回颗粒细胞下层的Brd U阳性细胞大部分已移位,除了向颗粒细胞层迁移外,在门区有较多新生细胞,还有少部分细胞在分子层。除DG区外,CA1区和CA3区均可见Brd U阳性细胞。(3)SC组DG区、CA1区、CA3区内Brd U/Neu N双标阳性细胞占Brd U阳性细胞的比率分别为57.29%、46.29%和53.84%,较正常对照组的68.24%、80.23%和76.37%均显著下降(p值均<0.05);SC组DG区、CA1区、CA3区内Brd U/GFAP双标阳性细胞占Brd U阳性细胞的比率分别为38.24%、41.27%和43.72%,较正常对照组的20.49%、10.59%和19.37%显著增加(p分别<0.05,0.001,0.05)。(4)免疫印迹法检测SC组和正常对照组大鼠海马组织GFAP和Neu N的蛋白表达情况。SC后7天两组海马组织内GAFP和Neu N蛋白表达均无显著统计差异;而SC后28天,SC组GFAP表达量较正常对照组增加(t=3.679,p=0.0062),Neu N表达量较对照组减少(t=3.621,p=0.0068),这种差异在SC后60天仍然存在。(5)尼氏染色发现SC后28天海马结构严重破坏,神经元丢失,可见散在的核溶解,SC组海马DG、CA1、CA3区尼氏染色细胞计数较正常对照组均明显减少(p<0.05)。(6)SC后1d海马Notch1m RNA表达较正常对照组有升高趋势,但差异无统计学意义(t=2.291,p=0.0512)。SC后3d Notch1m RNA表达较对照组有明显升高(t=3.555,p=0.0074),而SC后60d明显减少(t=4.942,p=0.0011)。不同时期SC组内差异具有统计学意义(p=0.0001)。SC后海马区Hes1m RNA的变化特征与Notch1相似,即SC后1d和3d海马区Hes1m RNA表达均高于正常对照组(t1=3.020,p1=0.0166;t3=4.657,p3=0.0016),SC后60d较对照组减少(t=3.879,p=0.0047),不同时期的SC组内差异具有统计学意义(p<0.0001)。(7)免疫组化方法检测SC后1天、3天、60天海马DG区Notch1蛋白的表达情况。可见Notch1在整个DG区都有表达。进一步免疫印迹法检测SC后1天Notch1蛋白表达开始较正常对照组增加(t=3.030,p=0.0163),SC后3天增加更加明显(t=4.833,p=0.0013),而SC后60天Notch1蛋白表达量却较对照组减少(t=4.463,p=0.0017)。NICD1蛋白有同样的变化趋势,而Numb1在SC后存在与Notch1相反的变化。结论:(1)幼年鼠长时程惊厥后急性期海马神经发生显著增加,慢性期神经发生减少。(2)SC后海马神经干细胞有明显的异位迁移现象,较多新生细胞向门区迁移,部分细胞迁移至内分子层、CA1区和CA3区。(3)SC后海马神经干细胞分化比例失衡,神经元损伤增加,星形胶质细胞增生,导致海马结构破坏。(4)SC后急性期海马内Notch信号途径被激活,慢性Notch信号途径被抑制。Notch信号途径的动态改变规律与SC后海马神经发生的动态变化一致。第二部分SC后急性期干预Notch信号途径对未成熟脑海马神经发生的影响目的:探索在SC后急性期抑制Notch信号通路后,海马神经干细胞增殖、分化的变化情况,观察其对SC所致胶质增生和海马神经元丢失的影响。方法:选取20日龄的SD大鼠60只,采用氯化锂-匹罗卡品腹腔注射诱导建立SC模型后,侧脑室注射γ-分泌酶(γ-secretase)抑制剂DAPT干预Notch信号途径的活化状态。将实验对象随机分为SC模型组、侧脑室注射DAPT组和侧脑室注射溶媒DMSO组,进行如下实验:(1)SC后3天免疫印迹法检测Notch1蛋白表达情况,验证DAPT对Notch信号通路的影响。(2)Bru U标记NSCs,免疫荧光方法检测SC后3天海马DG区神经干细胞增殖情况。(3)免疫荧光染色双标Brd U和GFAP或双标Brd U和Neu N,检测SC后28天DG区神经干细胞分化为星型胶质细胞和神经元的情况。(4)免疫印迹法检测SC后28天和60天海马组织GFAP和Neu N的蛋白表达。(5)尼氏染色观察SC后28天海马神经元丢失的情况。结果:(1)SC后3天抑制剂DAPT组大鼠Notch1蛋白表达低于SC组(t=3.194,p=0.0127),也低于溶媒DMSO组(t=2.910,p=0.0196)。而DMSO组Notch1蛋白表达与SC组比较无明显差异。(2)SC后3天注射DAPT组大鼠海马DG区Brd U阳性细胞显著少于SC组,(t=4.923,p=0.0012),溶媒DMSO组海马神经干细胞增殖情况与SC组无明显差异。(3)SC后28天,DAPT组中Brd U、Brd U/GFAP双阳性、Brd U/Neu N双阳性细胞数平均分别为27.29、7.36、18.01,均少于SC组(分别为68.24、25.93、38.89)和DMSO组(分别为65.33、24.17、37.45),差异有统计学意义(与SC组比较p分别为<0.05,0.01,0.05;与DMSO组比较p均<0.05)。Brd U/GFAP双阳性细胞比率在DAPT组为27.0%,低于SC组的38.0%和DMSO组的37.0%(p<0.01)。Brd U/Neu N双阳性细胞比率在DAPT组为66.0%,高于SC组的57.0%和DMSO组的57.3%(p<0.05)。(4)SC后28天DAPT组海马内GFAP表达较SC组和DMSO组均有减少(p<0.05),SC与DAPT组的差异到SC后60天更加明显(t=4.325,p=0.0025)。SC组与DMSO组的GFAP蛋白表达比较无显著统计学差异。SC后28天DAPT组海马内Neu N表达较SC组有增加(t=2.464,p=0.0390),这种差异到SC后60天更加明显(t=3.363,p=0.0099)。SC组和DMSO组的Neu N蛋白表达在SC后28天无统计学差异,但到SC后60天DAPT组有所增加(t=2.779,p=0.0240)。(5)尼氏染色显示,DMSO组CA3区细胞排列较SC组相对整齐、致密,核溶解较SC组减少。但在CA1区,DMSO组仍见明显核溶解,细胞排列较紊乱。在DAPT组,CA3区和CA1区的神经元排列均较SC组更加整齐、紧密,细胞层次清晰,细胞大小和形态基本正常,胞浆内有均匀蓝染的Nissl体颗粒,在CA3区和CA1区神经元丢失较SC组和DMSO均有减少。结论:DAPT干预可以有效抑制未成熟脑SC后急性期Notch信号通路的活化水平,可显著抑制海马神经干细胞的增殖及海马神经干细胞向胶质细胞方向分化,增加神经干细胞分化为神经元的比例,减少SC后神经元丢失,有助于修复海马结构。第三部分SC后急性期干预Notch信号途径对未成熟脑癫痫形成的影响目的:探讨急性期使用DAPT干预Notch信号途径对未成熟脑癫痫形成机制的影响。方法:选取72只20日龄SD大鼠,采用氯化锂-匹罗卡品腹腔注射诱导建立SC模型后,侧脑室注射DAPT干预Notch信号途径的活化状态。采用随机数字法将实验动物随机分成正常组、SC组和DAPT组每组各24只。其中,正常组5只和拟建模组10只大鼠在建立SC模型前3天安装颅内脑电图电极,待大鼠伤口愈合后建立SC模型。建立SC模型后,DAPT组在SC模型建立后侧脑室注射DAPT抑制Notch通路活性。长时程脑电图监测观察慢性期自发性反复癫痫发作(spontaneousrecurrentseizures,SRS)的情况。于SC后28天留取脑组织标本,透射电镜观察海马突触超微结构的差异。体外无镁诱发脑片放电的方法分析SC后28天海马脑片惊厥易感性的变化。Timm染色分析SC后28天海马苔藓纤维出芽情况。结果:(1)透射电镜显示,与正常对照组相比,SC组突触前膜活性带长度减少(t=3.406,p=0.0067),突触间隙增宽(t=3.441,p=0.0063),突触后膜致密物模糊不清,突触后膜致密物厚度减少(t=3.213,p=0.0093)。与SC组比较,DAPT组突触前膜活性带长度增加(t=2.242,p=0.0489),突触后致密物厚度增加(t=2.267,p=0.0468),突触间隙宽度增大的幅度较SC组无显著差异。(2)脑电图监测显示,DAPT干预组在SC后慢性期也发现有SRS,但其平均每次发作的持续时间(t=2.326,p=0.0423)、放电频率(t=3.181,p=0.0098)以及平均每天发作的次数(t=2.256,p=0.0477)较SC组均明显减少。肉眼观察DAPT组大鼠行为学表现较SC组严重程度显著减轻,主要为双眼凝视、面肌抽搐,少有单侧或双侧的前肢阵挛。(3)利用膜片钳技术记录海马脑片在无镁记录液诱导后的自发性放电。DAPT组平均潜伏期为25.64min,长于SC模型组14.16min,差异有统计学意义(t=3.364,p=0.0099)。SC组和DAPT组脑片自发性放电持续发作时间均以小于5分钟的次数最多,其中DAPT组中平均为4.10次,少于SC组的6.46次(t=3.119,p=0.0143)。DAPT组中发作时间超过30分钟的平均为0.80次,少于SC组1.86次(t=3.027,p=0.0164)。(4)苔藓纤维染色发现,同龄正常鼠CA3区和DG区可见少量细小苔藓颗粒。SC后28天SC组CA3区和DG区苔藓纤维颗粒明显增加,Timm评分增加(t=4.189,p=0.0030),苔藓纤维密度增加(t=4.444,p=0.0022)。DAPT干预后CA3区和DG区Timm评分及苔藓纤维颗粒密度均较未干预SC组无显著差异。结论:SC后急性期使用DAPT干预Notch信号途径可一定程度修复突触超微结构损伤,降低未成熟脑惊厥易感性,有效减轻SRS期痫性放电的严重程度,提示SC后急性期抑制Notch信号通路有助于阻止癫痫形成,其作用机制可能与SC后海马苔藓纤维出芽无明显关系。