目的通过采集几个代表性产地的杜仲树皮,比较其内生真菌的种群结构差异；研究不同季节杜仲皮内生真菌的种群结构及其与外部环境因子的相关性；构建不同产地杜仲皮的HPLC/Q-TOF-MS指纹图谱,比较不同产地、不同季节杜仲皮中成分及含量的差异性,分析不同季节有效成分的动态积累变化,并分析这种差异与杜仲皮组织中内生真菌种群之间的相关性；同时,分析代表性内生菌株发酵产物中化学成分,将其与杜仲皮中化学成分进行比较,为探索杜仲皮内生真菌与宿主之间相互作用关系提供了一定的思路及线索。方法(1)采用平板分离法分离来自慈利、略阳和遵义三个产地的杜仲干皮内生真菌,通过形态和分子手段相结合的方式对分离出的真菌进行鉴定,统计不同产地杜仲皮内生真菌菌株数,并计算其多样性指数及相似度,采用Clustal X1.81进行多重序列对比,再利用MEGA5.1软件进行系统发育分析,构建邻接树。同时,采用Kimura2-parameter model对同属的序列构建遗传距离矩阵。(2)采用与不同产地内生真菌研究相同的方法,对不同季节杜仲皮内生真菌进行分离及鉴定,统计不同季节内生真菌菌株及种群数,计算不同季节内生真菌的多样性及相似度,并运用Canoco生态学统计软件,对不同季节内生真菌的种群结构与其气候因子的相关性进行分析。(3)采用HPLC/Q-TOF-MS技术建立不同产地杜仲皮HPLC/Q-TOF-MS液质联用指纹图谱,运用SPSS软件进行聚类分析,寻找不同产地的差异。(4)应用HPLC/Q-TOF-MS方法,对采集的不同产地及不同季节杜仲药材进行含量测定,运用SPSS16.0统计软件,以各菌属的相对频率为自变量,PDG、Au或GPA的含量为应变量,将杜仲皮中有效成分与其内生真菌种群结构进行相关与回归分析,评估杜仲皮内生真菌与宿主有效成分之间的关系。(5)采用HPLC/Q-TOF-MS技术对分离得到的代表性内生菌株发酵产物进行检测,并与杜仲样品进行对比,寻找相同或相似代谢产物。结果(1)从三个产地杜仲皮中共分离得到152株内生真菌,分属于8个属,其中Phomopsis、Diaporthe、Alternaria为三个产地内生真菌共有属,各产地的优势种群不同。相似性分析表明,不同产地杜仲皮内生真菌的组成结构上存在差异；多样性及均匀度分析表明,慈利和略阳产地杜仲皮内生真菌种群多样性较高,分布较均匀。遵义产地杜仲皮内生真菌种群的多样性指数及均匀度指数最低,优势种群集中,奇异度较高。拟茎点菌属与其有性态间座壳属菌株的系统发育及遗传距离分析,不同产地杜仲皮中拟茎点菌属及其有性态真菌多样性丰富。(2)多样性分析结果表明,11月和1月的杜仲皮内生真菌种群多样性丰富,分布较均匀,而3月和7月杜仲皮中内生真菌优势菌群集中,奇异度较高,种群较单一。影响杜仲皮内生真菌季节差异的重要气候因子为最小相对湿度、降水量、平均相对湿度,不同种属内生真菌受气候因子影响存在较大差异。(3)不同产地的15批药材有22个共有峰,通过数据比对及质谱分析,鉴定14个特征峰,对指纹图谱的聚类分析结果显示云南和四川产杜仲皮与其他产地之间差异性较大。(4)不同产地5种主要有效成分含量差异较大,略阳产地和慈利产地质量较优。季节变化的规律显示,3、5月份杜仲皮中有效成分含量较高,质量较佳。内生真菌种群结构与宿主杜仲皮中有效成分的相关与回归分析表明,拟茎点菌属和间座壳属内生真菌与5种有效成分含量密切相关,正负影响因成分的不同而有所差异。(5)从五种杜仲皮内生真菌的发酵产物及杜仲样品的总离子流图与紫外图的对比上,发现4处共有峰,但通过质谱分析,未找到内生菌株发酵产物与杜仲皮提取物中相同的化学成分,还有待进一步的研究。结论杜仲皮组织中的内生真菌具有多样性,不同产地及不同季节内生真菌的数量、组成及种群间存在显著差异；影响不同季节杜仲皮中内生真菌种群差异的主导气候因子为最小相对湿度、降水量、平均相对湿度；不同产地杜仲皮中的化学成分组成及含量存在差异,主要有效成分含量的差异性与杜仲皮的内生真菌密切相关,其中拟茎点菌属和间座壳属的真菌对杜仲皮中有效成分影响较大；对五种杜仲皮内生真菌发酵产物检测未发现与杜仲皮中相同的化学成分,推测内生真菌对宿主化学成分为间接影响,二者互作机制有待进一步研究。